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基于二元混合自组装包裹纳米颗粒微传感器抗体固定方法 　　摘 要 采用二元混合自组装膜修饰纳米金颗粒，在经自组装单分子层修饰的金电极上阵列式排布，并通过共价键固定抗体形成生物敏感膜。采用原子力显微镜、扫描电镜和阻抗谱分别对电极表面的修饰过程进行了表征。纳米粒子在微电极表面均匀分布，没有明显的团聚, 并且可实现抗体有效固定。基于标准互补金属氧化物半导体（Complementary metal oxide semiconductor, CMOS）工艺和微加工技术，利用该抗体固定化方法，制备了糖化血红蛋白免疫微传感器，可同时检测血液中的糖化血红蛋白和血红蛋白含量，其对糖化血红蛋白和血红蛋白的检测范围分别为14～170 　　??SymbolmA@ g/L和167～570 　　??SymbolmA@ g/L。 　　关键词 纳米金; 互补金属氧化物半导体; 微加工; 糖化血红蛋白; 集成芯片 　　 2010-08-10收稿；2010-11-01接受 　　本文系国家973计划项目 (No. 2009CB320300)和国家863计划项目(No. 2006AA04Z366) 资助 　　?? E-mail: shxia@mail.ie.ac.cn 　　1 引 言 　　目前，便携式生物传感器的研究已成为热点，但很多免疫传感器还是基于酶标或者抗原抗体标记等方法，繁琐、耗时且造价较高［1,2］。一些研究者应用离子敏场效晶体管 （Ion sensitive field-effect transistor, ISFET），在较宽范围内实现快速免标记的免疫检测。ISFET以基于标准互补金属氧化物半导体（Complementary metal oxide semiconductor, CMOS）工艺制备，为生物传感器微型化及批量生产提供了一种新思路。基于ISFET的微型免疫传感器，可实现快速无标记检测。 　　在免疫传感器制备过程中，固定抗体是非常关键的步骤。随着传感器从厘米尺度减小到毫米尺度，免疫传感器的敏感表面面积也变得很小，可以固定在敏感表面的生物分子量也随之减少［3］。如何在微型传感器敏感表面上高效固定生物分子，并且有效控制其表面特性，成为了微型免疫传感器的研究难点。 　　纳米粒子的引入对于增强表面信号是一个非常有益的手段［4］。纳米粒子具有较高的比表面积，使得微型传感器表面的生物分子固定量呈指数倍增长。自组装单分子层与生物大分子以分子键结合，性能稳定，生物相容性强并能抑制干扰信号。然而单一成分的自组装分子层容易造成较大的空间位阻，阻碍生物大分子的固定效率。二元混合自组装膜的二维空间结构能够降低电极表面固定化抗体的空间位阻，使抗体具有良好的空间分布，有助于抗体的固定，及保持抗体的免疫活性［5］。 　　本研究在纳米金颗粒表面修饰包裹二元混合自组装膜，再将修饰过的纳米金颗粒固定到经自组装单层膜修饰的电极表面，共价键固定抗体形成生物敏感膜。本方法利用了纳米颗粒比表面积大的特点，增加了抗体的固定量；同时，纳米颗粒引入了特定的功能团，有利于生物分子的稳定结合，并能减少非特异性的结合，降低噪声干扰。此外，修饰的自组装膜使纳米颗粒在液相中均匀分散，将纳米颗粒固化到电极表面后，也能保持均匀分散，有效抑制了纳米颗粒的团聚。采用此抗体固定化方法制备了检测糖化血红蛋白的微传感器。本微传感器由采用标准CMOS工艺加工的场效应传感集成芯片和采用微加工技术制备的栅电极试条组成［6,7］，可实现糖化血红蛋白和血红蛋白的同时检测。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Gamry Reference 600电化学分析仪 （美国Gamry公司）； S-4800扫描电镜 （FE-SEM，日本Hitachi公司）； Nanoscope IV原子力显微镜 （美国Vecoo公司），轻敲工作模式。 　　糖化血红蛋白抗体、血红蛋白抗体（北京怡成生物技术有限公司）；糖化血红蛋白质控品（美国Fitzge-rald公司）；巯基乙胺，16-巯基十六酸 （HSC15H30CO2H））, 3-硫基丙酸 （HSCH2CH2CO2H）, 1,2-二氯乙烷（EDC）, N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）, 纳米金溶胶 （8～12 nm in diameter）, 磷酸盐缓冲液 （PBS, pH 7.4）均购自美国Sigma公司； SU8 2100胶（美国MicroChem公司）。其它试剂均为分析纯，购自北京化学试剂公司。 　　2.2 免疫微传感器制备 　　微型免疫传感器包括ISFET集成芯片和一次性微型延长栅电极阵列（图1）。微型延长栅电极阵列在柔性材料上由MEMS工艺制备，分为糖化血红蛋白和血红蛋白两个通道，每个通道都有金敏感电极和金钝化电极，两个通道共用一个铂参比电极。两个