基于PCR技术现代分子生物学操作在中药鉴定中应用.docVIP

基于PCR技术现代分子生物学操作在中药鉴定中应用 　　[摘要] 全文着重介绍了以聚合酶链式反应（PCR）技术为支撑的现代分子生物学技术，包括随机扩增多态性DNA（RAPD）技术、ISSR-PCR技术、PCR-RFLP技术、mRNA差异显示技术、基因测序技术及基因芯片技术在中药鉴定中的应用，指出现代分子生物学技术的蓬勃兴起将极大地推动中药鉴定的发展。 　　[关键词] PCR技术；分子生物学技术；中药鉴定 　　[中图分类号] R282.7 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2013）03（a）-0025-03 　　我国劳动人民几千年来在与疾病作斗争的过程中，通过实践，逐渐积累了丰富的医药知识。千百年来，中药在维系国人的身体健康方面发挥了不可替代的作用。中药包括植物药、动物药和矿物药，品种繁多，加之各地的用药品种和用药习惯不尽相同，同名异物和同物异名现象屡见不鲜。为规范药材市场、鉴定中药真伪优劣，确保中药的质量与疗效，建立一套准确、简捷、迅速的鉴定方法迫在眉睫。 　　近年来分子生物学的发展突飞猛进，特别是聚合酶链式反应（PCR）技术的问世，推动分子生物学的各个领域向纵深发展[1]。基于PCR技术的现代分子生物学操作在中药鉴定中得到应用，以其独具的准确性和可靠性，弥补了传统中药鉴定中的许多不足，展现出其他方法难以比拟的优势。 　　本文以PCR技术为切入点，着重介绍目前在中药鉴定中运用较多的几种分子生物学操作技术，希望能够抛砖引玉，合众人之力增加中药鉴定中的现代元素，推动中药鉴定方法的改进与革新。 　　1 PCR技术概述 　　PCR技术由美国Karray等学者于1985年首创，并由美国Cetus公司开发研制。PCR技术原理是根据已知DNA片段序列，人工合成与该DNA两条链末端互补的寡核苷酸引物，在酶促作用下将待检DNA序列进行体外扩增。 　　PCR反应体系基本成分包括模板DNA（待扩增DNA）、引物、4种脱氧核苷酸（dNTPs）、DNA聚合酶和适宜的缓冲液。类似于DNA的体内复制过程，PCR反应的特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。 　　PCR由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：①变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，双链DNA解离为单链；②退火：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③延伸：DNA模板与引物的结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对原则，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链。重复上述反应步骤，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。如此循环往复，在短短的几个小时的时间里，模版DNA链便可被扩增几百万倍。 　　PCR技术使人们能够在体外进行DNA的复制，它的意义在于DNA是遗传密码的载体，具有相对的遗传稳定性，每种生物都有其固定的遗传密码。只要得到某种物质的微量细胞并将其细胞内的遗传物质提取出来，再通过PCR技术将其扩增，就会准确无误地判断该物质，进而判断该物种。PCR技术以其独具的可靠性和准确性，在中药材基原鉴定和真伪鉴别方面拥有广阔的应用空间。 　　2 基于PCR技术的现代分子生物学技术 　　PCR技术是现代分子生物学的基石，该项技术的问世具有划时代的意义。以PCR技术为基础，分子生物学领域衍生出多种新的实验操作技术，在生命科学的各个领域均得到广泛的应用。本文仅对应用于中药鉴定过程的几种操作技术进行介绍。 　　2.1 RAPD技术 　　RAPD即随机扩增多态性DNA，该技术建立在PCR技术基础之上，可对整个未知序列的基因进行多态性分析操作。RAPD技术以基因组DNA为模板，以单个人工合成的随机多态核苷酸序列为引物，在热稳定的DNA聚合酶（Taq酶）作用下，进行PCR 扩增。扩增产物经电泳、染色后，在紫外透视仪上检测多态性。扩增产物的多态性反映了基因组的多态性。 　　目前，RAPD技术已应用于中药材的种质鉴定及伪品鉴别等方面。徐鹏等[2]运用RAPD技术对广西钩藤属药用植物进行遗传多态性分析，获得多态性条带231条，多态率达到88.9%。结果表明，3种广西钩藤属药用植物的聚类结果与其地理分布一致，所得RAPD标记可用于钩藤属药用植物的多态性研究；李雄英等[3]运用RAPD技术对绞股蓝及其伪品进行DNA指纹图谱的鉴别研究，实验结果证实该技术可有效地鉴别绞股蓝及其伪品乌蔹莓。 　　2.2 ISSR-PCR技术 　　简单序列重复区间（inter-simple sequence repeats，ISSR）是近年来发展起来的一类新型的分子标记技术，具有多态性高和重复性好等优点，已广泛用于药用植物的鉴定和遗传多样性研究[4]。