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获得目的基因方法的选择为了研究基因全长结构调控
获得目的基因方法的选择 第三讲 DNA的分离和纯化 Preparation of Plasmid DNA by Alkaline Lysis MATERIALS Buffers and Solutions: Alkaline lysis solution I Alkaline lysis solution II Alkaline lysis solution III Antibiotic for plasmid selection Ethanol Phenol:chloroform (1:1, v/v) TE (pH 8.0) containing 20 μg/ml RNase A Media: LB 溶液I,50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA,pH 8.0;溶液II,0.2 N NaOH / 1% SDS;溶液III,3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸 溶液I的作用:50 mM葡萄糖是保证悬浮后的大肠杆菌不会快速沉积到管子的底部,EDTA是Ca2+和Mg2+等二价金属离子的螯合剂,抑制DNase的活性,和抑制微生物生长在溶液I中加入高达 10 mM 的EDTA,无非就是要把大肠杆菌细胞中的所有二价金属离子都螯合掉; 溶液II是用新鲜的0.4 N的NaOH和2%的SDS等体积混合后使用的要新从浓NaOH稀释制备0.4N的NaOH,为了保证NaOH没有吸收空气中的CO2而减弱了碱性; 溶液III加入后就会有大量的沉淀,是十二烷基硫酸钠遇到钾离子后变成了十二烷基硫酸钾(potassium dodecylsulfate, PDS),溶液III加入后的沉淀实际上是钾离子置换了SDS中的钠离子形成了不溶性的PDS,而高浓度的盐,使得沉淀更完全。SDS专门喜欢和蛋白质结合,平均两个氨基酸上结合一个SDS分子,钾钠离子置换所产生的大量沉淀自然就将绝大部分蛋白质沉淀了。 2 M的醋酸是为了中和NaOH,因为长时间的碱性条件会打断DNA,所以要中和之基因组DNA一旦发生断裂,只要是50-100 kb大小的片断,就没有办法再被PDS共沉淀了所以碱处理的时间要短,而且不得激烈振荡,不然最后得到的质粒上总会有大量的基因组DNA混入。 METHOD 1.???? Inoculate 2 ml of LB containing the appropriate antibiotic with a single colony of transformed bacteria. Incubate the culture overnight at 37°C with vigorous shaking. 2.???? Pour 1.5 ml of the culture into a microfuge tube. Centrifuge at maximum speed for 30 seconds at 4°C in a microfuge. Store the unused portion of the original culture at 4°C. 3.???? Remove the medium by aspiration, leaving the bacterial pellet as dry as possible. 4.???? Resuspend the bacterial pellet in 100 μl of ice-cold Alkaline lysis solution I by vigorous vortexing. 5.???? Add 200 μl of freshly prepared Alkaline lysis solution II to each bacterial suspension. Close the tube tightly, and mix the contents by inverting the tube rapidly five times.?Do not vortex!?Store the tube on ice. 6.???? Add 150 μl of ice-cold Alkaline lysis solution III. Close the tube and disperse Alkaline lysis solution III through the viscous bacterial lysate by inverting the tube several times. Store the tube on ice for 3-5 minutes. 7.???? Centrifuge the bacterial
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