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基于拉曼光谱分析寒地水稻叶片有机结构 　　摘要：为了从分子水平探讨水稻病菌的传播和发病机制，特别是与分子病理学和分子药物学有关的研究项目的开展，需要研究细胞内生物大分子的结构及结构与功能的关系。利用拉曼光谱仪对正常水稻叶片进行拉曼光谱采集，指认出水稻叶片细胞中重要组成成分的拉曼特征频率，如羰基、亚甲基、巯基、氨基等多种官能团，并对拉曼光谱曲线中出现的特殊结构进行理论分析和解释。然后针对细胞组成的两大成分，即蛋白质和遗传物质的结构构像进行相应的拉曼光谱分析。通过分析水稻叶片中各部分的二级结构构象给出全面的分析和解释，实现了水稻叶片半定量分析的目的。为今后寒地水稻病害早期检测的对比分析提供了理论基础。 　　关键词：拉曼光谱；蛋白质；遗传物质；官能团；二级结构 　　中图分类号： S511.01 　　文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）04-0358-03 　　寒地水稻是指东北地区所产的单季晚稻品种。水稻病害是影响寒地水稻产量的重要因素之一，每年均有病害发生，严重时可以减产40%～50%[1-2]。研究水稻病害内部发病机制以及对水稻叶片结构破坏的机制具有重要意义。对水稻叶片检测通常采用透射电镜、多光谱成像技术、高光谱成像技术等方法，这些方法已经能够较准确地识别水稻病害情况，但仍存在识别方法普适性差、无损检测方法缺失的问题[3]。拉曼光谱是一门基于拉曼散射效应而发展起来的光谱分析技术，体现的是分子的振动或转动信息，与常规化学分析方法相比，拉曼光谱技术具有无损、快速、环保、灵敏度高、稳定性好且无需制样等特点[4-5]。崔向荣等利用拉曼光谱技术检测骨髓间充质干细胞在电磁场照射后蛋白质、脂类、核酸等结构和数量的变化的可行性，得出3 000 Hz 脉冲电磁场对骨髓间充质干细胞产生了分子层面的影响[6]。Waleed等利用拉曼光谱技术检测PC12细胞裂解液在细胞内DA水平的生化成分的变化[7]，同时确定拉曼光谱在检测细胞外DA水平处理剂的变化与运用高效液相色谱法结果一致。董蓉等应用单细胞拉曼分析技术结合PCA方法，以枯草芽孢杆菌芽孢为对象，探究芽孢在强碱胁迫下的致死机制[8]。由此可见，利用拉曼光谱技术在生物、农业等方面的应用越来越广泛，已经成为一种有效的检测手段。但目前利用拉曼光谱对水稻植株检测的研究较少。因此，本研究利用拉曼光谱和水稻叶片细胞组织的知识理论进行研究，以期为水稻病害早期检测的对比分析提供一定的理论基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 样品的采集 　　水稻叶片样本2011―2014年采集于黑龙江省农垦总局建三江分局下属胜利农场科技示范园区的26.67 hm2试验田，品种为垦稻19号。水稻是蒸腾作用非常强的农作物，正常天气采集下来的水稻叶片10 min之内便会因为叶片水分降低出现明显的卷叶现象，所以采集样本必须现场采摘叶片，并直接在附近的室内进行拉曼光谱采集。 　　1.2 试验方法 　　选用由DeltaNu公司生产的Advantage 532型拉曼光谱仪，采用背向接收的方式采集拉曼光谱信号，在波段200～3 400 cm-1 范围内对现场样本进行拉曼光谱采集。采集到的原始数据，一是利用编写的Matlab程序进行数据处理，得到样本光谱的峰值，并显示处理以后的光谱图像；二是通过结合Berjot方法针对二级碳、三级碳、四级碳以及谱线展宽与水稻叶片内结构进行关联分析，对照拉曼光谱特征频率表，得到寒地水稻叶片中大部分关键化学键的拉曼光谱分析结果[9]。 　　2 结果与分析 　　2.1 细胞中重要成分在拉曼光谱中的分析 　　利用拉曼光谱分析仪在中等激光强度、532 nm波长、曝光时间1 s、无偏振检测的条件下采集正常水稻叶片的拉曼光谱，采集波数范围为200～3 400 cm-1。几丁质结合蛋白是在植物中主要存在的物质，其中半胱氨酸（cysteine）是几丁质结合域的主要特征。半胱氨酸分子式为HSCH2CH（NH2）COOH，它含有羰基―CO、亚甲基―CH2―、巯基―SH、氨基―NH2等多种官能团。446、535 cm-1分别对应半胱氨酸羧基（―COOH）的面内摇摆振动和面外摇摆振动，是区别于胱氨酸、乙酰半胱氨酸的标志特征峰。从峰值相对强度可以看出在水稻叶片中半胱氨酸含量相对较少，导致标志特征峰强度低。695 cm-1为半胱氨酸的C―S键，其实此处谱峰是693、 695 cm-1 峰的叠加谱峰，但由于仪器分辨率不高，故只能看到1个明显的拉曼峰。990、1 043 cm-1为半胱氨酸中的甲基（―CH3），它们同属于甲基的面内摇摆振动。同时可以看到 990 cm-1峰的强度偏弱，再次说明半胱氨酸的含量较少。1 043 cm-1附近峰是个椅形结构，在1 043 cm-1附近的几个波数内是一种水平