大鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法对GFAP表达影响.docVIP

大鼠大脑皮层星形胶质细胞不同体外培养方法对GFAP表达影响 　　【摘 要】目的：比较体外培养纯化星形胶质细胞的不同方法对星形胶质细胞影响，为进一步研究奠定基础。方法：原代培养后分别经振荡纯化、传代纯化的方法培养星形胶质细胞。结果：原代培养的星形胶质细胞纯度不高；经振荡纯化后GFAP表达量明显增多，GFAP免疫荧光变亮；经传代纯化培养后纯度达到97%，GFAP表达量较少。结论：经过传代纯化的星形胶质细胞纯度较高，GFAP表达量较少，因此能更好地反映其在脑中的功能，是研究星形胶质细胞在脑中的功能较好的培养方法。 　　【关键词】星形胶质细胞；体外培养；胶质纤维酸性蛋白 　　【中图分类号】R-311 【文献标识码】A 【文章编号】1004-7484（2014）06-3494-01 　　【Abstract】Objective： Comparing different ways of isolation and purify astrocytes from mouse cerebral tissue to Learn the effect of astrocytes for future study of their functions in the brain. Methods： To acquire purified astrocytes by two usually used cultural methods： after primary culture， subculture for three times or shanken overnight twice. Results： The purity of primary culture was the lowest ，with the method of being shanken over night twice highly expressed GFAP， Immunofluorescence staining with anti-mouse GFAP was brighter. Astrocytes purified by being subcultured for three times over 97% purity. The expression of by GFAP low. Conclusion： With the subcultural method we can acquire the purer astrocytes in vitro， which the expression of by GFAP lower， and can best reflect their functions in the brain. It’s an optimal method to acquire the astrocytes for future study of their functions in vivo. 　　【Key words】astrocyte； in vitro； glial fibrillary acidic protein 　　反应性星形胶质细胞及星形胶质细胞与神经元的关系一直以来都是神经科学界关注的热门课题[1]，体外分离纯化星形胶质细胞己有三十余年的历史，为众多研究提供了实验基础，也大大促进了对Ast的特性研究。虽然获取星形胶质细胞的方法较多，但一般研究偏重星形胶质细胞的纯度而较少关注其生物学特性。而不同的体外培养方法可能影响Ast活化，表现为GFAP不同程度的表达，进而可能影响实验结果，本研究将文献常报道的两种方法进行比较，观察不同试验方法对GFAP表达影响，从而获得一种纯度既高，又能满足不同实验要求的星形胶质细胞纯化方法。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 SD乳鼠（泰山医学院实验动物中心）；DMEM/F12粉剂（Gibco产品）；兔抗人GFAP多克隆抗体（北京中杉金桥）；Cy3标记抗兔IgG免疫荧光试剂盒（碧云天生物技术研究所）；细胞核染色剂DAPI（碧云天生物技术研究所）； Image-proplus4.0图像分析系统（IPP公司）。 　　1.2方法 　　1.2.1 星形胶质细胞纯化培养 选用SPF级、出生时间不超过48 h的健康SD乳鼠，75%乙醇浸泡消毒后，处死、取出大脑移入含有预冷的D-Hank’s液培养皿中，洗涤并去除脑膜，夹取少许大脑皮层组织D-Hank’s液中洗涤、剪碎，0.125%胰蛋白酶消化后终止，过滤、离心，弃上清，重新加入培养基，制成单细胞悬液，接种到培养瓶中，差速粘附处理2次。再次制成单细胞悬液，接种至预先用多聚赖氨酸包被过的培养瓶中， 37℃、5%CO2培养箱培养， 7～9 d后，细胞已80