大鼠脂肪干细胞转运VEGF基因促进随意皮瓣成活率研究.docVIP

大鼠脂肪干细胞转运VEGF基因促进随意皮瓣成活率研究 　　鲁开化　赵京禹　孙同柱　韩　冰　陈　伟 　　[摘要]目的：探讨人血管内皮细胞生长因子(VEGF165)基因转染大鼠脂肪干细胞(rADSCs)的稳定表达系统对皮瓣成活的影响。方法：①培养和鉴定大鼠ADSCs，脂质体介导pcDNA3．1－VEGF165质粒转染大鼠(rADSCs)，经G418筛选抗性rADSCs并继续培养4周，用ELISA法检测转染后细胞培养上清中VEGF浓度。②Brdu标记被转染rADSCs后，在大鼠背部制备8．0cm×2．5cm的随意型皮?模型，实验组(10只大鼠)为注射pcDNA3．1-VEGF165质粒转染的rADSCs悬液到大鼠腹腔，对照组(8只大鼠)为注射2ml被空载体pcDNA3．1(一)转染的rADSCs悬液，术后7天用透明纸描记法记录皮瓣成活范围，记数坐标纸格子并换算为成活面积百分率。分别于术后3天、5天、7天在成活皮瓣的远端切取皮瓣组织标本行免疫组化染色。结果：①ELISA检测4株转染和经G418筛选抗性并继续培养2周的第二代rADSCs上清中VEGF浓度多达(4．21±0．35)pmol VEGF／1×106细胞／48h(x±s，n=4)，有2株细胞培养液上清分泌VEGF较强，其余2株细胞相对较弱，均大于对照的空载体转染组和未转染组rADSCs培养液上清中的(0．49±0．15)pmol VEGF／1×106细胞／48h(x±s，n=3)和(0．61±0．86)pmol VEGF／1×106细胞／48h(x±s，n=3)，均P0．01，差异有统计学意义。分泌VEGF较强的rADSCs经Brdu标记后阳性率达到70％以上。②将获得的稳定表达VEGP165的rADSCs移植到随意型皮瓣动物模型体内，7天后实验组皮瓣的成活面积为(59．6±0．52)％，大于对照组的皮瓣成活面积(40．5±0．27)％(P0．01)。成活皮瓣的远端组织标本切片在显微镜下可见皮下脂肪中有大量核仁深染棕黄色的细胞。结论：ADSCs可以作为载体细胞运送VEGF基因到达皮瓣远端并通过分泌VEGF提高皮瓣的成活面积。 　　[关键词]成体干细胞；基因治疗；随意型皮瓣 　　[中图分类号]Q789　[文献标识码]A　[文章编号]1008―6455(2007)01-0007-04 　　 　　皮瓣是用于修复较大的组织缺损和外露脏器的带血供的皮肤软组织，但是在转移手术后皮瓣经常发生血运障碍。研究表明，血管内皮细胞生长因子(VEGF)可以促进血管的新生，从而提高缺血皮瓣的成活面积。成体干细胞载体可以治疗多种疾病。研究表明，MSC等成体干细胞可以作为中枢神经性疾病等多种疾病的基因治疗载体，例如MSC可以作为VEGF、FGF等多种细胞因子基因治疗的载体，并通过旁分泌作用释放VEGF促进侧支循环的建立和血管的再生，而MSC自身则不参与缺血组织的治疗。目前ADSCs作为基因治疗载体的报道较少见，本研究旨在阐明脂肪干细胞可以作为运送VEGF基因到达皮瓣的细胞载体并通过旁分泌VEGF提高皮瓣的成活面积。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1材料：3周龄SD大鼠18只(雌雄不限)、Lipo-fectamineTM2000(美国Sigma公司)、pcDNA3．1-VEGF165质粒(本室构建并保存)、DMEME(Dul―beccos modified eagle balancedsalt solution)培养基、0．1％Ⅰ型胶原酶(美国Worthington公司)、CD49天抗体(北京中山生物技术公司)、恒温CO2培养箱、台式离心机(LingLi公司)、Calibur型四色流式细胞仪(美国Becton Dickinson)、DMIRB型倒置相差显微镜(德国Leica公司)。 　　1．2方法 　　1．2．1 rADSCs的分离和原代培养：SD大鼠麻醉后，在无菌下切取腹股沟脂肪垫，剪碎后加入0．1％Ⅰ型胶原酶消化40～60min，加入2倍体积的D-Hank’s液，离心收集沉淀并用含10％胎牛血清的高糖DMEM培养基稀释，转种到培养瓶中。 　　1．2．2 rADSCs的鉴定：收集处于对数生长期的第2代rADSCs，95％乙醇固定和漂洗后分别加入鼠抗鼠的CD49天单克隆抗体，4℃过夜，PBS洗掉未结合的抗体，加入异硫氰酸荧光素标记的羊抗鼠二抗，室温下放置30min，PBS洗掉未结合的抗体。用流式细胞仪检测。同时用PBS／FBS／NANO3代替一抗作为空白对照。 　　1．2．3脂质体介导VEGF转染rADSCs：生长到70％～80％融合的细胞，用新鲜无血清DMEM培养基洗涤2遍。按LipofectamineTM2000操作说明，pcDNA3．1(一)、pcDNA3．1－V