姜黄素对人宫颈癌细胞株Hela细胞增殖作用研究以及p53表达影响.docVIP

姜黄素对人宫颈癌细胞株Hela细胞增殖作用研究以及p53表达影响 　　【摘要】 目的：主要探讨姜黄素对人类宫颈癌Hela细胞中增殖作用的影响，以及细胞p53蛋白表达的影响。方法：本文通过不同浓度姜黄素干预人宫颈癌Hela细胞，采用MTT法检测药物对Hela细胞的增殖抑制率；RT-PCR和Western blot检测细胞凋亡相关蛋白p53表达。结果：MTT发现姜黄素对人宫颈癌Hela细胞有一定的抑制作用，并呈时间-剂量依赖性；RT-PCR结果显示p53mRNA的表达增加；western boltting显示p53蛋白的表达增加。结论：姜黄素可一直Hela细胞增殖，其机制可能是通过增加p53基因的表达而实现。 　　【关键词】 姜黄素； 宫颈癌； p53mRNA； p53蛋白 　　姜黄素（Curcumin）是一种酚类化合物，提取自姜科姜黄属植物姜黄（Curcumalonga）的根茎中，是中药姜黄的主要成份。国内外的科学研究表明，姜黄素具有具有抗炎、抗氧化、保肝、保护心脏、预防血栓和抗肿瘤的多种生物学效应[1-4]。姜黄素可以调节多种肿瘤相关的细胞因子及通路达到抗肿瘤的作用，对宫颈癌细胞具有一定的细胞毒作用 [5]。但是有关姜黄素对宫颈癌细胞体外作用的相关机制仍有待研究。本文主要探讨姜黄素对人类宫颈癌Hela细胞的相关作用，检测p53蛋白的表达情况，为姜黄素防治宫颈癌提供新的依据。 　　1 材料与方法 　　1.1 细胞 人宫颈癌Hela细胞株（中国医学科学院血液病研究中所惠赠）。 　　1.2 主要试剂 姜黄素、二甲基亚砜（DMSO）、MTT购自美国Singma公司；胎牛血清购自杭州四季青生物工程材料有限公司；DMEM高糖型购自美国Gibco公司；RT-PCR 反应试剂盒北京天根生化科技有限公司；高纯总RNA快速提取试剂盒（RTL-离心柱型）购自上海锐捷生物工程有限公司；蛋白提取试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司；p53抗体购自美国Bioworld Technology公司；鼠抗β-actin抗体北京中杉金桥生物技术有限公司。 　　1.3 细胞培养 宫颈癌Hela细胞株采用加入100 mg/L 链霉素和100 U/L 青霉素各1 ml的DMEM培养液，置于 37℃、5% CO2 饱和湿度的培养箱中培养，待细胞长至体积占细胞瓶体积比约 95%时，按1：2～3比例传代。取细胞生长良好，活性大于98%的细胞进行后续试验。 　　1.4 姜黄素对Hela细胞增殖影响的检测 用MTT法检测姜黄素对Hela细胞增殖影响。用含有10%胎牛血清的DMEM培养液将的Hela细胞配成 1×105/ml的悬液，在96孔板中加入 100μl细胞悬液，设5个平行孔。实验组加入不同浓度的姜黄素使其最终浓度为5、10、20、30、40、50μmol/L， 同时设置对照组，分别培养12、24、48 h。培养结束后加入MTT（5 mg/L）20μl继续培养4 h，小心吸出孔内上清液100 μl，每空加入DMSO150 μl，震荡使结晶充分溶解，酶标仪测定读取Hela细胞的A490值，并按下述公式计算细胞增殖抑制率，重复实验3次以上。抑制率（%）=（1-给药组 A490值/对照组A490值）×100%。 　　1.5 姜黄素对人宫颈癌Hela细胞细胞中p53基因 mRNA 转录水平表达的影响的检测 用RT-PCR法检测细胞中p53基因 mRNA 转录表达水平。收集姜黄素最终浓度为0、10、20、30、40 μmol/L的24 h Hela细胞为样本。用离心柱法提取总的RNA，根据紫外分光光度计260nm处的吸光度值测定RNA的纯度，并进行RNA的定量配成相同浓度的RNA，取1 μg总RNA进行逆转录，以cDNA为模板，进行PCR。引物由上海生工生物工程有限公司设计合成见表1。p53基因扩增的反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；58℃退火30 s；72℃延伸1 min；循环36次；72℃再延伸10 min。β-actin 反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；63℃退火30 s；72℃延伸1 min；循环36次；72℃再延伸10 min。PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝胶电泳分析，凝胶成像系统保存图像，重复实验3次后，Quantity One 系统进行灰度分析。见表1。 　　1.6 姜黄素对人宫颈癌Hela细胞中p53蛋白含量表达的影响的检测 姜黄素对人宫颈癌Hela细胞细胞中p53蛋白水平表达的影响的检测用Western blotting法检测细胞中p53蛋白表达水平。收集姜黄素最终浓度为0、10、20、30、40 μmol/L的24 h三个时段Hela细胞为样本。用RIPA细胞裂解液裂解细胞，蛋白提取试剂盒提取蛋