荧光免疫技术抗核抗体ANA检测间接免疫荧光法.PPTVIP

荧光免疫技术 抗核抗体（ANA）检测 间接免疫荧光法（IIF） 黄卓春 免疫学 检测方法 免疫沉淀法 免疫凝集法 酶免疫检测技术 荧光免疫技术 电化学发光技术 …… 共同的基础 抗原抗体 反应 检测方法 沉淀 凝集 显色 荧光 电子发光 …… 荧光免疫技术——抗原抗体反应与荧光标记技术结合，对抗原 或抗体进行定性、定位或定量检测 抗核抗体的检测——间接免疫荧光法 荧光免疫技术 间接 荧光标记的二抗 F F 直接法： 荧光标记的抗体 优点：步骤少 缺点：每种抗体都需要标记荧光，不通用 间接法： 荧光标记的二抗 优点：通用荧光二抗 缺点：步骤多 抗核抗体的定义 抗核抗体的检测 抗核抗体检测策略 抗核抗体的临床意义 讨论要求 ANA（antinulear antibody）定义 传统定义：是指抗细胞核抗原成分的自身抗体 ? 狭义定义 现代定义：是指抗细胞内所有抗原成分的自身抗体 对ANA的理解已不再局限于核成分，而是指一类抗核酸和核蛋白等细胞成分抗体的总称 ? 广义定义 抗核抗体的定义 ANA细胞靶抗原成份模式图 真核细胞 高尔基体 分泌颗粒 粗面内质网 核仁 核粒子 糖原颗粒 溶酶体 细胞骨架蛋白 细胞膜 线粒体 滑面内质网 中心粒 推荐采用以HEp-2细胞（Human Epithelial Cells,人喉癌上皮细胞株）为底物的间接免疫荧光法(Indirect ImmunoFluorescence assays, IIF) 优点：① HEp-2细胞形态大，细胞抗原种类齐全，分裂期成份（如着丝点、纺缍体、中心粒）等丰富（抗原齐全） ②IIF法可直接观察针对细胞成份的抗体（形态直观） 抗核抗体的检测 试剂与器材 ? ANA检测试剂盒 包被组织切片的生物薄片（Hep2细胞、猴肝片） PH7.2 磷酸盐缓冲液/吐温20 标记FITC羊抗人二抗 阴性、阳性质控 石蜡（封片介质，PH8.4） ? 加样枪，试管，洗片槽，荧光显微镜 ⑥ 荧光显微镜观察 ① HEp-2细胞（底物片试剂盒） ② 加入标本反应 ④ 加入荧光二抗反应 ③ 洗去未反应血清蛋白 F F F F F ⑤ 洗去多余荧光二抗 自身抗体 非特异蛋白 ANA检测原理和步骤 检测过程 : 2 步反应 + 2步洗涤 + 1步观察 包被组织切片的生物薄片 加样板 加25ul待测样本后盖板,避免产生气泡 洗涤（先冲洗后浸泡） PBS-Tween20 擦干生物薄片四周洗液 待测血清稀释100倍 20ul血清+2mlPBS稀释液 室温温育30分钟 浸洗至少5分钟 操作步骤 生物薄片编号，如1,2,3 实验报告注明所加样本号 (如1-1,5051；1-2,5047) 阴阳质控不稀释 加样板上加入FITC标记20ul二抗后，盖板 室温温育30分钟 洗涤（先冲洗后浸泡） PBS-Tween20 浸洗至少5分钟 擦干薄片四周洗液 石蜡(一小滴)封片 (勿用力挤压) 荧光显微镜下观察结果 操作步骤 封片不可用力挤压盖玻片，以免损坏基质。 可左右挪动盖玻片以使其正确嵌入载片凹槽里。 注意事项 （1）试剂不经复温直接使用会降低反应温度，底物片凝集水珠会影响反应效果，使用前要复温。 （2）标本稀释应准确，样本浓度过高或过低会造成假阳性或假阴性结果。 （3）FITC标记的荧光二抗使用前需混匀。 （4）反应时间应严格控制，延长或缩短反应时间将影响反应效果。 （5）洗涤步骤是影响检测结果最关键的一步，洗涤不充分将会增加非特异染色，从而影响观察效果。 注意事项 （6）洗涤时先冲洗后浸泡，注意水流不要太急，不要直接对着基质冲。 （7）擦板要小心，要分清正反面, 擦拭抗原板四周的液体要求小心，不能碰到抗原板上包被地组织切片。 （8）盖片的时候，要将薄片上的凹孔对准加样板左边的小突起，然后轻轻放下，见液滴完全浸泡住组织切片。 （9）封片时候将盖玻片放于加样板上，于相应的数字位置轻轻点滴甘油，甘油的量不易过多，挤出后在其成滴落下前在玻片上点滴。 （10）荧光染色后应尽可能及时观察， 不能及时观察应4℃避光保存，以减少荧光淬灭。 细胞核 细胞浆 细胞骨架 细胞周期 IIF法检测ANA荧光染色模型 均质型 核糖体型 肌动蛋白型 中心粒型 颗粒型 线粒体型 波形蛋白型 纺缍体型 核仁型 高