实时荧光定量PCR检测非小细胞肺癌组织中SP70表达及意义.docVIP

实时荧光定量PCR检测非小细胞肺癌组织中SP70表达及意义 　　【摘要】 目的 探讨非小细胞肺癌（NSCLC）组织中SP70抗原的表达及意义。方法 选取40例肺癌组织作为肺癌组[NSCLC 32例（NSCLC组）， 小细胞肺癌8例（小细胞肺癌组）]， 另取20例良性病变肺组织作为肺良性病变组， 采用实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）相对标准曲线法检测各组中SP70抗原表达的相对水平， 定量分析其与临床组织病理学特征的关系。结果 肺癌组SP70平均表达水平为（1.798±1.275）pmol/μl， 明显高于肺良性病变组的（0.921±0.238） pmol/μl， 差异有统计学意义（P0.05）。结论 SP70可能是评价NSCLC的一个潜在的指标。 　　【关键词】 SP70抗原；非小细胞肺癌；实时荧光定量聚合酶链反应 　　DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2017.12.030 　　寻求肺癌早期检测指标及方法是目前研究热点， 近期有研究发现一株能特异性识别NSCLC的McAbNJ00l， 此抗体对NSCLC的免疫性诊断和治疗意义重大， 其所针对的靶抗原为相对分子质量70000的胞浆新抗原SP70， SP70与NSCLC关系密切[1]。本研究采用实时荧光定量PCR（Q-PCR）相对标准曲线法检测40例肺癌组织和20例良性病变肺组织中SP70的表达水平， 分析其表达与临床组织病理学特征的关系， 评价其在临床诊治中的应用价值。 　　1 材料与方法 　　1. 1 材料来源 本院2014年8月～2015年6月手术切除的肺癌组织40例作为肺癌组， 其中NSCLC 32例（NSCLC组）， 小细胞肺癌8例（小细胞肺癌组）。另取20例手术切除的肺良性病变组织作对照（肺良性病变组）， 均由病理确诊， 标本收集后立即保存于-80℃冰箱。Trizol液和逆转录试剂盒购自美国Invitrogen公司。TSYBR GreenI荧光染料：北京天根公司。引物由北京诺赛基因公司设计并合成， 目的基因SP70 F： 5′- CCAGTTCAAGTGCTCGG CAT-3′；R： 5′- TTGCTC TTGGAACCTCGGAC-3′。内参β-actin F： 5′-GTGACGTTGACATC CGTAAAGACC-3′；R：5′-CTAG GAGCCAGGGCAGTAATCT -3′。荧光定量PCR仪：Step one V2.1（美国ABI公司）。 　　1. 2 方法 　　1. 2. 1 总RNA提取及cDNA合成 按Trizol裂解抽提法提取总RNA， 常规检测其纯度、浓度及完整性， 将RNA逆转录合成cDNA后存放-20℃冰箱备用。 　　1. 2. 2 标准曲线的制备 将PCR产物目的条带通过吸附柱式琼脂糖DNA回收法进行回收纯化， 测其浓度后再以10倍系列梯度进行连续倍比稀释成106～101 copies/μl数量级的标准品， 进行实时荧光定量PCR扩增生成标准曲线。 　　1. 2. 3 相对标准曲线法实时荧光定量PCR扩增 每份标本均扩增SP70和β-actin， 20 ul反应体系：SYBR GreenI reaction mixture：10 ul， 目的基因（10 pmol/μ1）上、下游引物各0.4 μl， cDNA模板2 μl， ddH2O：17.2 μl。反应条件：95℃预变性2 min， 然后95℃20 s， 60℃30 s， 68℃45 s共40个循环， 按PCR仪默认条件进行溶解曲线分析， 每份标本重复3次， 通过扩增曲线及溶解曲线判定结果是否是阳性。 　　1. 2. 4 数据的标化处理 以同一样本β-actin模板量为参照， 标化计算SP70的相对模板数， 即：SP70/β-actin。 　　1. 3 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示， 采用t检验。P0.05表示差异具有统计学意义。 　　2 结果 　　2. 1 荧光定量PCR评价指标 SP70标准曲线线性关系良好。见图1。扩增效率R20.998， 溶解曲线只有一个单峰。见图2。特异性高， PCR产物在87.0℃以上获得单一熔解峰， 经琼脂糖电泳后所得产物是目的基因SP70所要扩增的条带。 　　2. 2 实验结果 肺癌组SP70平均表达水平为（1.798± 　　1.275）pmol/μl， 明?@高于肺良性病变组的（0.921±0.238） pmol/μl， 　　差异有统计学意义（P0.05）；NSCLC组SP70平均表达水平为（2.334±1.268）pmol/μl， 高于小细胞肺癌组的（1.171± 　　1.286）pmol/μl， 差异有统计