实时荧光定量聚合酶链反应对不典型肺结核诊断价值.docVIP

实时荧光定量聚合酶链反应对不典型肺结核诊断价值 　　【摘要】目的探讨实时荧光定量聚合酶链反应（PCR）技术检测支气管肺泡灌洗液结核分枝杆菌DNA对不典型肺结核的诊断价值。方法对88例均为我院已经确诊的门诊及住院不典型肺结核患者的支气管肺泡灌洗液进行实时荧光定量PCR检测结核分枝杆菌DNA，另选80例笔者所在医院呼吸病房非结核肺部疾病者作为对照（其中急慢性支气管炎36例，肺炎、支气管扩张各15例，肺癌14例）。结果88例患者支气管肺泡灌洗液实时荧光定量PCR检测阳性60例（69%），80例对照组支气管肺泡灌洗液实时荧光定量PCR检测阳性2例（2.5%）。2组阳性率比较，差异有统计学意义（P0.01）。结论支气管肺泡灌洗液实时荧光PCR检测对不典型肺结核早期诊断有重要的价值。 　　【关键词】不典型肺结核；支气管肺泡灌洗液；实时荧光定量；聚合酶链反应 　　不典型肺结核在临床上有较高的发病率，临床上对该疾病的诊断主要是根据临床症状、体征以及必要的实验室检查，病原菌在诊断中较少发现。荧光定量PCR作为一种对基因型的诊断方法，具有特异性强、灵敏度高的优点。该文章通过采用荧光定量PCR技术对结核分枝杆菌DNA进行检测，观察该检查方法是否有助于诊断，现报道如下。 　　1资料与方法 　　1.1一般资料选取笔者所在医院2010年9月――2012年2月88例不典型肺结核患者，其中男43例，女45例；年龄16-76岁，平均（28±8）岁。通过常规检查确诊为不典型性肺结核，全部经过治疗后康复，经过随访没有复发病例。所有患者经过笔者所在医院做支气管肺泡灌洗，取得支气管肺泡灌洗液标本，对该标本行实时荧光定量PCR检测，另选80例笔者所在医院呼吸病房非结核肺部疾病者作为对照研究。 　　1.2方法 　　1.2.1标本获取局部麻醉后用纤维支气管镜分别收集于用硅油处理过的容器中及时送检。 　　1.2.2实时荧光定量PCR检测方法取1-1.5ml支气管肺泡灌洗液置离心管中，离心去上清，离心速度为12000r/min，时间5min。将沉淀加入无菌生理盐水1ml震荡混匀，如果沉淀效果不好可以以同样的转速和时间重复离心一次，在沉淀加入50μmDNA提取液，充分混匀，放在100℃恒温箱中10min；4℃冰箱冷却至室温后，再次离心备用。取上清液2微升加入PCR反应管，8000r/min离心数秒，将反应管放入PCR仪，PCR仪对DNA的扩增条件为：93℃2min预变性，以后的温度和时间分别是93℃，45s；55℃，60s在该环境中进行10个循环，然后按93℃，45s；55℃，120s，进行30个循环。PCR反应后对标本做荧光检测，记录读数。 　　1.3统计学处理文中所有数据采用SPSS11.5软件对数据进行处理，计数资料采用χ2检验，以P0.05为差异有统计学意义。 　　2结果 　　所有患者经过荧光PCR检测，结果测得阳性者60例，阳性率为69%，其中32例患者实时荧光PCR检测拷贝数在1×102/ml-1×103/ml，该部分患者的灌洗液颜色为黄色；4例患者的拷贝数1×104/ml以上，该部分患者的灌洗液为脓性液体。80例对照组标本中经过该检查仅得到1例阳性结果，阳性率为2.5%。两组患者阳性率比较，差异有统计学意义（P0.01）。 　　3讨论 　　临床对不典型肺结核的诊断，目前主要根据该疾病特有的临床症状、体征、以及必要的实验室检查同时参考治疗转归的具体情况做出推测性诊断。PCR以其特异、敏感、快速的特点，已成为诊断结核病的重要方法。结果表明，支气管肺泡灌洗液PCR检测结核分支杆菌的阳性率高。究其原因，是支气管肺泡灌洗液直接取材于病变部位，获得结核分支杆菌的机会增多之故，因此更适合痰菌含量少、肺部病灶局限、未与引流支气管相通、肺结核暂时稳定期的病例，尤其是无痰和少痰菌阴者，且可减少口咽部对标本的污染。纤支镜检查的“激惹”作用和冲洗，使排痰增加，提高痰的阳性检出率，使支气管肺泡灌洗液成为痰涂阴肺结核诊断的一项重要方法。 　　传统PCR技术对不典型肺结核诊断价值的报道较多，其诊断的阳性率为35.21%-69%，但是该技术有较多的缺点，应用中不能准确定量、容易造成交叉污染而产生假阳性，临床上较少适用。实时荧光定量PCR是在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术。与其他PCR技术不同的是，在反应体系中加入了荧光团，作为一种标记物检测整个PCR的进程，最后通过标准曲线对未知模板，对检测液中的DNA进行定量的分析。该技术有其他技术不能比拟的优点，在实验定量分析的同事还具有较高的灵敏度，特异性较强，可靠性高，自动化，无交叉污染，实时性和准确性较高，但目前较少适用，临床数据也不多，较少报道。 　　该文章对88例不典型肺结核患者的胸腔积液行实时荧光定量PC