第三章 研究方法-1.pptVIP

第一节 细胞形态结构观察技术 0.61λ D= —————— N·Sin α/2 以锇酸和戊二醛 固定样品，以环 氧树脂包埋，以 热膨胀或螺旋推 进的方式推进样 品切片，切片厚 度20~50nm，切片 采用重金属盐染 色，以增大黑白 反差。 用重金属盐（如磷钨酸、醋酸双氧铀）对铺展在载网上的样品进行染色；吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸出处则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。 由于电子束不能透过玻璃，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有0.05?m的超薄切片，并放在铜网上。这种切片需要用超薄切片机 制作。电子显微镜的放大倍 数最高可达近百万倍。 1. 超薄切片技术 二、主要电镜制作技术： 超薄切片 铜网 示肌动蛋白纤维 2. 负染色技术 亦称冰冻断裂(freeze-fracture)，是研究生物膜内部结构的一种有用的技术，关于膜结构的许多资料即是利用这种方法取得的。 冰冻断裂技术也是研究细胞内部各种细胞器结构的有用手段。 (freeze-etching) 3. 冰冻蚀刻技术 ①将标本于-100℃干冰中或-196℃液氮中，超低温冰冻。 ②然后用冷刀骤然将标本冲断开，升温后冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面结构——蚀刻(etching)。 蚀刻 断裂 冰冻蚀刻技术的操作步骤: ③蚀刻后，再向断裂上喷涂一层蒸汽碳和铂。然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下，此膜即为复膜(replica)。 复膜 ④复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于透射电镜下观察。电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。 * * Chapter3-1 Techniques for Cell Biology Cell 第一类研究方法 形态观察技术 第二类研究方法 生物化学分析技术 第三类研究方法 V 细胞生理学技术 第四类研究方法 其它实验技术 目镜 物镜 集光器 载物台 光源 1. 普通光镜的结构: （一）普通光学显微镜 一、光学显微镜 2. 普通光镜的成像原理 2? 图像 样品 光线 聚光器 物镜 光学显微镜的光路图 在普通光学显微镜下，细胞结构呈半透明状，不易看清。 往往将标本切片进行染色——提高可辨程度。 移动臂 蜡或树脂包埋的样品 切片用钢刀 样品切片蜡带 伸展在盖玻片和 载玻片之间的切片 切片机 染色的原理 未染色 已染色 1. 紫外光显微镜 紫外线显微镜以紫外线(波长介于400nm与X射线之间)为光源，分辨率可提高1倍，可以看到许多在普通光学显微镜下看不到的胶体颗粒。 此外，核酸和有些蛋白质可吸收一定波长的紫外线，因而这种显微镜可用来测定细胞核中的核酸含量。 （二）特殊光学显微镜 2. 暗视野显微镜 这种显微镜使照明光线不能直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜。 中央遮光板 暗视野聚光器的设计原理 视野的背景黑 物体的边缘亮 利用这种显微镜能见到小至5nm的质点，分辨率比普通显微镜高了40倍，有一些细胞器，如核、线粒体，均清晰可见。 3 . 相差显微镜 由荷兰物理学家F. Zernike(1932)发明：提高了活细胞结构的反差，从而解决了对活细胞观察的难题。 获诺贝尔物理奖(1953) (phase contrast microscope) 光通过不同密度物质时滞留的时间 不同，利用相差板，将厚度的差别转 化成明暗的差别，增加反差。 特点：在聚光器或光源上加了一环形光阑(annular diaphragm), 在物镜中加了一环形相板(annular phase plate)。 相差显微镜的构造: 上有一环形区，制成凹槽或凸起（亦可涂上特殊物质）：环形区的设计深度（或高度）恰好可使通过此区的光线提前或延后1/4λ光程差。 环形光阑 环形相板 使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。 相差显微镜的构造 相差显微镜 的光路图解 根据设计，只有未透过标本的直射光可通过相板环形区，而透过标本的偏折光则由相板其他部分通过。两组光线和轴后发生干涉现象。 两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（正反差）——结构比周围介质更加变暗。 未透过标本的直射光（通过相板环形区）与透过标本的偏折光（由相板其他部分通过）和轴后发生干涉： S-D S D 如果为凹形相板： 通过样品的光线延后1/4 λ -1/4λ -1/4 λ 则两组光波相加，振幅加大，形成亮反差（负反差）——标本结构比周围介质更加变亮。 S+D S D 如果为凸性相板： 由于标本的各种结构的厚度和折射系数不同，在相差显微镜下显示出不同的明暗度。 -1/4λ +1/4 λ 4. 微分干涉差显微镜 Nomarski (1952)在相