Sphk1对缺血性脑损伤的双重作用-医学神经生物学专业论文.docxVIP

T T Sphkl 对缺血性脑损伤的双重作用 中文摘要 Sphk1 对缺血性脑损伤的双重作用 中文摘要 目的：研究鞘氨醇激酶 1（Sphingosine kinase l，Sphkl）对缺血性脑损伤的作 用机制。 方法：通过线栓堵塞小鼠大脑中动脉的方法建立缺血性脑损伤再灌注动物模 型(MCAO)。使用实时定量 PCR（Quantitative real-time PCR，RT-PCR）技术检测 小鼠脑缺血再灌后皮层 Sphkl 、Sphk2 和炎症因子的 mRNA 水平。通过免疫印迹 法（Western blotting）检测 Sphkl 蛋白在皮层缺血半暗带的表达情况。利用免疫荧 光技术（Tmmunofluorescence staining）观察在脑缺血皮层表达 Sphkl 的细胞类型。 将小鼠在缺血再灌注后随机分成溶剂组(Vehicle)和 Sphkl 的抑制剂 5C 组，并于再 灌注后 3 h，l2 h，24 h，48 h 和 72 h 分别给予溶剂或 5C（2mg/kg），以 l% 2， 3， 5-tripheyltetrazolium chloride（TTC）染色的方法检测小鼠在 MCAO 后 24 h 和 96 h 的脑梗死体积。使用 Z-Longa 评分方法观察 Sphkl 抑制剂对 MCAO 后 96h 神经功 能的影响。使用侧脑室注射 small-interfering RNA (siRNA) 的方法分别特异性地抑 制 MCAO 后 Sphkl，Sphk2 和 TRAF-2 的基因在缺血脑皮层的表达，以 TTC 染色 法探讨 Sphkl、Sphk2 和 TRAF-2 对脑梗死体积的影响； 通过检测 Evans Blue 外 渗情况及脑内血红蛋白的含量检测 Sphkl 对 MCAO 后血脑屏障完整性的作用；以 免疫共沉淀法（Co-Tmmunoprecipitation，Co-TP）研究 MCAO 后脑缺血皮层中 Sphkl 和 TRAF-2 的作用。 结果：在小鼠 MCAO 模型中，鞘氨醇激酶 1（Sphk1）在脑缺血的病理过程中 发挥双重作用。RT-PCR 结果显示：与对侧的皮层相比，在小鼠的脑皮层缺血半暗 带区 Sphk1 mRNA 被诱导表达，而脑缺血后 Sphk2 mRNA 的水平却没有发生变化； Western blotting 显示：在 MCAO 的动物模型中，小鼠脑皮层缺血半暗带区 Sphk1 的蛋白也较对侧明显升高。免疫荧光法显示：Sphkl 高表达于缺血侧皮层的半暗带 TT TT 中文摘要 Sphkl 对缺血性脑损伤的双重作用 区域，而且 Sphkl 主要与小胶质细胞和神经细胞标记共定位。TTC 染色和 Z-Longa 神经功能评分的结果显示：Sphkl 抑制剂 5C、Sphkl siRNA 和 TRAF-2 siRNA 能 显著降低脑缺血再灌注后的梗死体积，5C 能显著提高 MCAO 后 96 h 的神经功能 评分。Sphkl 抑制剂 5C 和 Sphkl siRNA 能显著抑制脑缺血导致的炎症因子 TL-l?、 iNOS、MMP 9 和 TNF-α mRNA 在缺血皮层的诱导表达。Evans Blue 结果显示：Sphkl siRNA 增加脑缺血后 Evans Blue 在脑内的渗出量；血红蛋白检测结果也发现：Sphkl siRNA 增加了 MCAO 后脑内血红蛋白的含量。Co-TP 的结果表明在皮层缺血半暗 带 Sphkl 和 TRAF-2 相互结合在一起。 结论：小鼠 MCAO 后， 在皮层缺血半暗带区神经元及小胶质细胞中 Sphkl 被诱导表达，抑制 Sphkl 能降低脑梗死体积和缺血后神经炎症应答，并改善神经 功能，但加剧血脑屏障的损伤和脑出血的风险。我们的研究表明 Sphkl 对缺血性 脑损伤具有双重作用，可能是脑缺血治疗的新靶点。 关键词：脑缺血；大脑中动脉堵塞模型；鞘氨醇激酶 1；血脑屏障 作 者：郑淑立 指导教师：程 坚 TTT TTT Dual role of Sphkl in cerebral ischemia Abstract Dual role of Sphk1 in cerebral ischemia Abstract Objective: To investigate the role of Sphingosine kinase l (Sphkl) in cerebral ischemia. Methods: Transient middle cerebral artery occlusion (MCAO) was induced in m