wnt5b诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的实验研究-胸心血管外科学专业论文.docxVIP

Wnt5b Wnt5b 诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究 中文摘要 Wnt5b 诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的 研究 中文摘要 目的：心肌梗死的致残致死率极高，已成为危及生命的重大疾病，现有的治疗手 段难以从根本上解决问题；干细胞治疗心肌梗死的前景相当广阔，但仍存在诸多问题， 例如：移植后干细胞分化率较低、存活率低等。本研究拟通过调节 wnt5b 基因的表达， 探讨 BMSCs 向心肌样细胞分化率的改变，旨在为临床心肌梗死的治疗提供更有效的 方法。 方法：选取 4 周龄 SD 大鼠胫骨提取骨髓间充质干细胞，利用贴壁法培养，传代 生长到 P3 代，以流式细胞仪检测细胞表面抗原，主要选用 CD29、CD 44、CD 34、 CD 45 鉴定骨髓间充质干细胞。选取生长良好的 P3 代骨髓间充质干细胞分为四个实 验组，分别转染 siRNA-空白对照（siRNA-NC）、wnt5b 基因沉默组（siRNA-wnt5b）、 PEX1-空白对照（PEX1-NC）、wnt5b 基因高表达组（PEX1-wnt5b），从而实现对 wnt5b 基因沉默及高表达，24h 后向每组细胞内加入心肌细胞裂解液诱导分化。在体外，于 3 天、7 天、14 天收取细胞，以 qPCR 检测各组细胞心肌特异性因子 Nkx2.5、GATA-4、 CX43、MyoD 的 mRNA 量；以免疫荧光检测各组细胞中的特异性 CX43、Desmin 表 达，比较各组荧光亮度；以蛋白印迹法(western blot, WB)检测各组细胞 Desmin、cTnT 蛋白表达量,比较各组特异蛋白表达的变化。在体内，建立大鼠心梗模型，48h 后注射 四组处理后的细胞，分别于术后第 1、28 天心超检测大鼠心功能指标，28 天后取出 心脏行 HE 染色，Masson 染色，免疫荧光等检测心肌分化指标。 结果：贴壁法分离得到 P3 代 BMSCs，镜下观察细胞长条状，呈极性生长，流式 鉴定细胞表面抗原 CD29、CD 44 阳性，CD 34、CD 45 阴性。处理后 3 天 qPCR 检测 心肌特异性因子，siRNA-wnt5b 组 Nkx2.5、GATA-4 表达量升高，而 PEX1-wnt5b 组 Nkx2.5 、 GATA-4 表达受到抑制，与对应的阴性对照组相比有统计学差异； siRNA-wnt5b 组 CX43、MyoD 表达量下降，而 PEX1-wnt5b 组 CX43、MyoD 表达略 升高，与对应的阴性对照组相比无统计学差异。处理后 7 天、14 天 qPCR 检测心肌 I PAGE PAGE IV 中文摘要 Wnt5b 诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化的研究 特异性因子，siRNA-wnt5b 组 Nkx2.5、GATA-4、CX43、MyoD 表达量升高，而 PEX1-wnt5b 组 Nkx2.5、GATA-4、CX43、MyoD 表达受到抑制，与对应的阴性对照 组相比有统计学差异。体外免疫荧光检测心肌特异性蛋白 CX43、Desmin，western blot 检测 Desmin、cTnT 蛋白表达， siRNA-wnt5b 组表达增高，PEX1-wnt5b 组表达降低。 建立心梗模型，向梗死心肌表面注射处理后的 BMSCs，转染 siRNA-wnt5b 组大鼠心 功能较转染 PEX1-wnt5b 组明显修复；Masson 染色分析心梗面积发现：siRNA-wnt5b 组梗死纤维组织面积最小，而 PEX1-wnt5b 组梗死纤维组织面积最大，与相应的阴性 对照组比较有统计学差异；HE 染色可见 siRNA-wnt5b 组较 PEX1-wnt5b 组心肌细胞 排列整齐，炎症细胞浸润减少；最后对注射 BMSCS 的心脏组织进行免疫荧光检测， CX43 在 siRNA-wnt5b 组表达增高，而 PEX1-wnt5b 组表达降低。 结论：wnt5b 在 BMSCs 向心肌样细胞分化中有重要的调控作用，上调 wnt5b 抑 制 BMSCs 向心肌样细胞分化，下调 wnt5b 则促进其分化； wnt5b 可能是通过改变 GSK-3β 的表达，调控 BMSCs 向心肌样细胞分化。 关键词：骨髓间充质干细胞；分化；心肌样细胞；wnt5b。 作 者：沈 晗 指导老师：沈振亚 教授 Research Research On Wnt5b induced BMSCs differentiation into cardiomyocyte-like cells Abstract Research On Wnt5b induced BMSCs differentiation into cardiomyocyte-like cells Abstract