对丝腺细胞因子SGF―1具有调控作用家蚕miRNAs功能研究.docVIP

对丝腺细胞因子SGF―1具有调控作用家蚕miRNAs功能研究 　　摘要： 为了研究家蚕miRNAs对丝腺细胞因子SGF-1表达的调控作用，以SGF-1为靶基因，利用生物信息学软件RNAhybrid和RNA22预测对SGF-1具有潜在调控作用的候选家蚕miRNAs，经茎环PCR鉴定后分别构建重组表达载体，在细胞水平研究家蚕miRNAs的功能。结果表明，转染了bmo-miR-305*重组质粒组的luc荧光素酶活性比未转染时极显著下调（P0.01）；转染了bmo-miR-3327*重组质粒组的luc荧光素酶活性比未转染时极显著下调（P0.01）；再各自转染了inhibitors后荧光蛋白表达量均上调（P0.05）。说明SGF-1 3′UTR上存在bmo-miR-305*和bmo-miR-3327*的结合位点，且bmo-miR-305*和bmo-miR-3327*对SGF-1的转录后表达具有一定抑制作用。 　　关键词： 家蚕；miRNAs；丝腺转录因子；SGF-1；功能鉴定 　　中图分类号： S881.2；Q78 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0053-06 　　microRNAs（miRNAs）作为重要的基因转录后表达调控因子，参与包括发育、代谢、疾病发生等各种重要的生理过程。目前国内外在家蚕miRNAs上开展了相关研究，进行了家蚕miRNAs的鉴定、表达谱分析以及功能预测。至2014年6月，miRBase数据库（http：///）21版本中已记录223个物种的35 828条成熟体miRNAs，并且其数量还在不断增长，其中，在家蚕中共发现487个miRNAs 前体和563个成熟体miRNAs。 　　大多数miRNAs主要通过与靶基因mRNA 3′端非翻译区（3′UTR）的互补配对，在mRNA或翻译水平负调控靶基因表达[1，2]。目前研究表明，miRNA 的负调控作用不仅存在于靶mRNA 的3′UTR 区，也可发生在5′UTR区[3]。前人研究认为，所有的miRNAs调控作用都是负调控，但Vasudevan等研究发现miRNA具有激活基因表达的作用[4]。Hussain等也通过试验证明除了常见的下调靶基因转录水平，miRNAs能够上调靶基因的转录水平[5]。Miyoshi等还证实了miRNAs除了能够作用于3′UTR外，还能够结合在靶基因的其他位置[6-7]。 　　miRNA和转录因子（transcription factors，TFs）一样，都能够在转录水平独立调控靶基因的表达水平，而越来越多的研究证明这两者之间能够通过相互作用更精准地对靶基因进行表达调控。通过计算机分析预测，Enright等指出在众多 miRNAs 的潜在靶基因中，TFs作为靶基因的可能性比一般基因大约高出2倍[8]。Cui等在研究基因调控中miRNAs与TFs的相互关系方面也作出了贡献，认为miRNAs更可能靶向含有大量TFs结合位点的基因，而这些基因通常也具有相对更多的miRNAs结合位点[9]。 　　SGF-1是丝腺特异性细胞因子[10]，存在于中、后部丝腺。SGF-1除了在丝素重链基因（Fib-H）、丝素轻链（Fib-L）和p25基因的上游有其结合位点外，还能与丝胶Ser1基因上游的SA区域结合[11]，说明SGF-1对家蚕丝蛋白基因的表达调控具有重要的作用，特别是在细胞特异性表达方面。而SGF-1自身的表达也要受到调控，为了验证家蚕miRNAs是否对SGF-1的表达具有调控作用，本研究以SGF-1 3′UTR为序列，利用生物信息学软件预测并获得候选miRNAs，通过体外细胞转染试验进行验证，初步筛选可能调控SGF-1的候选miRNAs，为进一步研究miRNAs的功能提供依据，也为阐明蚕丝蛋白合成及调控机制积累试验数据。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料及主要试剂 　　家蚕品种p50，由中国农业科学院蚕业研究所提供；E.coli DH10B菌株、昆虫BmN细胞系、重组表达载体质粒pcDNA3 [ie1-egfp-SV40]和重组表达载体质粒PGL3[A3-luc-SV40]均由中国农业科学院蚕业研究所农业部蚕桑遗传与改良重点开放实验室保存。 　　pMD18-T、限制性内切酶、T4 DNA Ligase、Ex Taq酶、PrimeScript RT-PCR Kit、RNAiso Plus和DNA maker均购自宝生物工程（大连）有限公司；质粒提取试剂盒购自生工生物工程（上海）有限公司；TC-100购自Applichem公司；Fetal Bovine Serum（Qualified，Australia Origin） 购自Gibco公司；UCallM PerFectTM购自药科美公司；双报告基因荧