VEGF及EPCs结合胶促进大鼠梗死心肌血管再生的可行性研究-内科学(心血管)专业论文.docxVIP

摘 摘 要 新疆医科大学医学博士学位论文 新疆医科大学医学博士学位论文 — — PAGE 11— — — PAGE 10— VEGF 及 EPCs 结合胶促进大鼠梗死 心肌血管再生的可行性研究 博士研究生：阿迪拉·阿扎提 导师：马依彤 教授 摘 要 目的：通过相应的组织工程方法使得心梗后心肌血管再生。本研究包括：1,研 究内皮细胞生长因子通过纤维蛋白胶释放到心肌从而刺激心肌血管的再生的可能性 并观察心功能改善情况；2, 通过可降解材料纤维蛋白胶将内皮祖细胞移植到大鼠心 肌观察心肌血管再生情况和心功能改善情况。方法：1,本课题第一部分选择了 28 只 9 周龄 SD 大鼠，其中 13 只进行了左前降支（LAD）结扎术导致左室急性心肌梗死 为心梗组，15 只大鼠未行结扎术为非心梗组。首先制作纤维蛋白胶以及构成重组体 α2-PI1–8-VEGF121，然后使二者结合构成 VEGF 结合胶用于移植。将 7 只心梗大鼠 和 6 只非心梗大鼠心脏移植了 VEGF 结合胶；作为对照对 6 只心梗大鼠和 6 只非心 梗大鼠移植了空白的纤维蛋白胶；另外 3 只为正常大鼠未作任何处理来作为组织学 对照。在心梗大鼠中，移植在心梗后即刻进行。所有大鼠保存 4 周，处死前行心功 能的超声检查。处死后对大鼠心肌进行组织学与免疫组织化学研究，即行 CD31 抗 体染色和 α-平滑肌肌动蛋白抗体染色（SMA）来探测血管。对非心梗心脏，首先定 义两个区域，即胶下和间隔区（远离胶）；而对心梗心脏定义为缺血区和间隔区。每 个区域在放大 200 倍条件下各采 3 张相片，每张共 6 张相片。应用生物通用分析处 理软件做定量的血管形态分析（为盲法）。通过 3 个参数来测量血管，即：①总的血 管密度（在总的组织中的血管数量/mm2）；②总的血管数在心肌区域中的比例（心 肌区域中的总血管数量/mm2）；③总血管区的百分比（总组织中血管区域的百分比）。 总的组织部分要去除白色空白区域来除外因不同原因所致的空白区域（如切片制作 过程中的破口等）所造成的偏倚,然后从总组织区域中去除血管区域来确定心肌区 域。生物通用处理软件直接将血管分成 3 组，即：毛细血管组（血管直径＜10μm）； 微血管组（10μm≤血管直径≤20μm）；大血管组（血管直径＞20μm）。动脉数量通 过肉眼确定，即将组织切片放大 100 倍条件下通过肉眼对其组织学特性的标准来区 别计数动脉数量。检测整个左室的动脉，动脉密度以每平方毫米总组织区域中动脉 血管的数量来表达；2,第二部分选择了 27 只 9 周龄 SD 大鼠，体重 300～350g。其 中 18 只进行了左前降支（LAD）结扎术导致左室急性心肌梗死，其余 9 只未行结 扎术。首先制作纤维蛋白胶以及从人脐带血中用磁珠法分离内皮祖细胞，然后将内 皮祖细胞种植于纤维蛋白胶构成载有内皮祖细胞的纤维蛋白材料用于移植。将大鼠 分为 3 个组：第一组为 9 只无心梗大鼠；第二组为 9 只心梗后立即进行移植的大鼠； 第三组为 9 只心梗后 1 周进行移植的大鼠。每个组在移植后 3 周或 8 周处死。为了 抑制大鼠对 EPCs 胶的免疫排斥反应本研究使用了微量渗透泵持续给予环保菌素 A。 大鼠处死前行经胸腔超声心动图检查以测定左室功能。处死后行组织学与免疫组织 化学研究，即经股静脉注射 15%KCI 2 毫升处死大鼠使大鼠心跳停止在舒张期，取 心脏进行福尔马林固定，蜡块包埋后做成 3μm 组织切片，行苏木精-伊红（HE）和 免疫组化染色, 人 CD34 抗体和 Tra-1-85 抗体染色来探测移植的人类细胞。心脏血 管测量的方法与 VEGF 相同，应用同样的采样方法。即 3 个 CD34 抗体染色切片， 用同样的方法在每个切片选择 1 个区域（非心梗心脏在胶下，心梗心脏在缺血区）， 且每个区域取 6 张相片。计算机评估血管的形态同第一部分。结果：1, VEGF 纤维 蛋白结合胶的血管生成效应：①首先为了除外因 VEGF 浓度过高使得血管的渗透性 增高导致渗漏并使得心包或胸膜渗出，肉眼检查分析了 VEGF 胶移植在大鼠左室壁 的效应，结果胸腔和心包均未发现异常渗出。在心脏和胸腔之间见到疏松的结缔组 织，与空白胶组比较没有统计学差异。组织学和免疫组化研究，HE 染色的心脏组 织切片无移植物的心脏和有移植物 4 周后的心脏，可见一些疏松的结缔组织，但其 在非心梗心脏中移植纤维蛋白胶组和未移植纤维蛋白胶组之间没有统计学差异可能 因手术或缝线所致。心脏结构为相对正常形态，无血管瘤或血管畸形等发现。结果 显示，与非心梗相比，在梗死心肌附近观察到含有新生血管的疏松结缔组织，但其 在 VEGF 胶组和空白胶组之间没有统计学差异。②血管检测 平滑肌细胞层的动脉 和静脉均由 α-平滑