Tim3和Tim4在小鼠心脏移植模型中的免疫调节作用机制研究-外科学(器官移植)专业论文.docx

华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 中文摘要 第一部分 流式细胞仪检测小鼠移植心内浸润淋巴细胞亚型 目的 建立简便而高效的分离小鼠心脏移植物内浸润淋巴细胞的方法，使用流式细胞 仪检测移植心内浸润淋巴细胞的亚型。 方法 建立小鼠颈部心脏移植模型，分实验组（同种异体移植组：Bal b/ c 小鼠为供体， C57BL/ 6 小鼠为受体）和对照组（同系移植组：供受体均为 C57BL/ 6 小鼠）。移植术后 3 天，5 天和 7 天获取移植心, 将其中一部分移植物进行病理切片观察排斥反应情况， 剩余移植物剪碎并采用改进的Ⅱ型胶原酶消化法（250 U/ ml ，30～40 mi n）消化心脏， 然后用 Ficoll 密度梯度离心法（800g×20 mi n）分离单个核细胞，以钙离子荧光染料 I ndo- 1 分析细胞活性，最后以荧光标记抗体 CD4，CD8，CD44，CD62L，Foxp3 进行流 式细胞染色，流式细胞仪检测移植物内浸润淋巴细胞亚群组成。 结果 移植物内分离的单个核细胞数量稳定在 1×106 以上，术后第 7 天数量达到最高 峰，分离所得的单个核细胞数量与排斥反应严重程度相关。淋巴细胞占分离所得单个 核细胞的比例为（31.9±2.3）%，活性为（95.1±2.1）%。移植物内浸润的 T 细胞大 部分为效应性 T 细胞，CD4+/CD8+ 比值随着排斥反应的进行逐渐降低。 结论 本法单用胶原酶消化移植心，采用 Ficoll 密度梯度离心法，减少了对心脏移植 物内浸润淋巴细胞的损伤，获得的细胞可进一步用于流式分析其表型，为直接检测浸 润到移植物内的淋巴细胞亚型提供一种高效和可靠的方法，是一种值得推广的免疫学 研究手段。 关键词 移植物；胶原酶Ⅱ；移植心浸润淋巴细胞；流式细胞仪 第二部分 Tim3 在小鼠心脏移植受者体内的表达变化 目的 检测 Ti m3 mRNA 在移植后移植物内的表达变化及 Ti m3 在受者体内不同部位 T 淋巴细胞上表达，探讨其与急性排斥反应的关系。 方法 建立小鼠心脏移植模型，分实验组（同种异体移植组：Bal b/ c 小鼠为供体， C57BL/ 6 小鼠为受体）和对照组（同系移植组：供受体均为 C57BL/ 6 小鼠）。移植术后 3 天，5 天，7 天和 9 天获取移植物，采用实时定量 RT- PCR 检测 Ti m3 mRNA 在移植物 内的表达变化。术后 3 天和 6 天分离受者外周血、脾脏、引流淋巴结、移植物内淋巴 细胞，流式细胞仪检测 Ti m3 阳性细胞在 CD4+ 和 CD8+ T 细胞中的比例。 结果 同基因组移植物内 Ti m3 表达很低。异基因组移植术后第 3 天移植物内 Ti m3 mRNA 的表达明显升高，并且 Ti m3 mRNA 的表达随着排斥反应的进行而显著升高( P 0. 01) ，于移植物完全排斥前达到最高峰，随后表达逐渐降低。移植术后受者外周血 和脾脏内 Ti m3 阳性细胞比例无明显变化（P 0. 05），引流淋巴结内 Ti m3+ / CD4+ 比 值轻度升高( P 0. 05) ，移植物内 Ti m3+ / CD4+ 和 Ti m3+ / CD8+ 比值显著升高( P 0. 01) 。 移植术后第 3 天和第 6 天引流淋巴结内 Ti m3+ / CD4+ 比值差异无统计学意义( P 0. 05) ， 而术后第 6 天移植物内 Ti m3+ / CD4+ 和 Ti m3+ / CD8+ 比值均显著高于第 3 天( P 0. 01) 。 结论 移植物内 Ti m3 mRNA 的表达与小鼠完全异基因心脏移植排斥反应的进展动态相 关。异基因组受者移植物引流淋巴结和移植物内 Ti m3+细胞比例升高，以移植物内升 高更为显著。 关键词 Ti m3；急性排斥反应；T 淋巴细胞；移植物 第三部分 Galectin-9 显著延长小鼠心脏移植物存活时间的实验研究 目的 观察 Gal ect i n- 9 对同种异体心脏移植物存活时间的影响，探讨 Gal ect i n- 9 激 活 Ti m3- Ti m3L 通路在小鼠心脏移植模型中的免疫调节作用。 方法 建立小鼠同种异体心脏移植模型，分实验组和对照组。实验组受者术后连续 7 天给予稳定的 Gal ect i n- 9 蛋白，对照组给予 PBS。观察心脏移植物存活时间。术后第 7 天获取实验组和对照组心脏移植物，病理切片观察排斥情况，免疫组化观察移植物 内浸润 CD4+和 CD8+T 细胞数量。实时定量 RT-