TRIM67对胃癌细胞增殖及凋亡影响机制的研究-外科学专业论文.docxVIP

万方数据 万方数据 目 录 中文摘要……………………………………………………………………1 英文摘要……………………………………………………………………5 英文缩写……………………………………………………………………9 研究论文 TRIM67 对胃癌细胞增殖及凋亡影响机制的研究 前言……………………………………………………………………10 材料与方法……………………………………………………………12 结果……………………………………………………………………20 附图……………………………………………………………………22 讨论……………………………………………………………………28 结论……………………………………………………………………35 参考文献………………………………………………………………36 综述 TRIM 蛋白家族的结构功能及其与肿瘤的关系…………………40 致谢…………………………………………………………………………51 个人简历……………………………………………………………………52 中 中 文 摘 要 TRIM67 对胃癌细胞增殖及凋亡影响机制的研究 摘 要 目的: 三结构域蛋白 67（TRIM67）是三结构域蛋白家族的其一个成 员，它在胃癌中处于沉默或下调的状态，目前在胃癌中未见相关文献，其 HYPERLINK /link?url=9NfmK6Z5Jcz7b-1ZGM5_IJrm9_lVC7A_9m2iFkXFlw3FYdg82bf5_CJDKmJqoKYca4uXlM_cdBg1wsYKdhFX3_amp;wdamp;eqid=eb060ddc000205d300000004568393bc 作用机制尚不明确。我们通过实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）、蛋白质印迹法（Western blot）及流式细胞术等相关实验技术验证 TRIM67 与胃癌细胞的生长、凋亡等之间的关系。主要阐明该基因在胃癌 中作为一个肿瘤抑制基因的生物学功能。 方法: 1 选取 21 对香港中文大学威尔斯亲王医院的胃癌组织和癌旁正常组 织样本为实验对象，运用实时荧光定量聚合酶链反应（Real-time PCR）测 定 TRIM67 基因在这 21 对样本中的表达水平，并分析胃癌组织和癌旁正 常组织中 TRIM67 的表达水平差异。 2 运用相关实验技术，①反转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR）验证 TRIM67 在胃癌细胞株（AGS、 BGC823、MGC803、MKN1、MKN45、MKN74、SNU1、SNU638）中的 表达水平；②运用亚硫酸氢盐测序法（bisulfite genomic sequencing, BGS） 对相关胃癌细胞株中 TRIM67 启动子序列进行检测；③应用 2uM 浓度的 5-氮杂-2-脱氧胞苷（5-aza-2-deoxycytidine, 5-Aza）对胃癌细胞株（AGS、 BGC823、MKN45、SNU1、SNU638）去甲基化处理 96 小时后，通过 RT-PCR 检测细胞株中的 TRIM67 的表达水平，并以未用 5-Aza 处理的对照组进行 对比。 3 构建 pcDNA3.1-2×Flag-TRIM67 重组质粒并转染胃癌细胞株 AGS 和 MKN1，以 pcDNA3.1-vector 为对照组，G418 筛选出 AGS 和 MKN1 稳定细胞株后，分别以 mRNA 和蛋白质水平检测该胃癌细胞株过表达 TRIM67 后的表达。运用 MTT 实验进一步表明 TRIM67 对胃癌细胞株细 胞生长活力的影响，并通过软琼脂克隆形成实验验证该基因对胃癌细胞生 长及集落形成能力的作用情况。 以 TRIM67 表达较高的胃癌细胞株 MKN74 为基础，应用 shRNA（short hairpin RNA）敲低 TRIM67 并获得 1 万方数据 万方数据 稳定细胞株。在 mRNA 水平检测转染该基因的表达情况，并运用 MTT 实 验和软琼脂克隆形成实验检测敲低 TRIM67 后对胃癌细胞增殖及集落形 成的能力。 4 以胃癌细胞株 AGS 和 MKN1 转染 pcDNA3.1-2×Flag-TRIM67 的稳 定细胞株和 pcDNA3.1-vector 对照组的稳定细胞株为基础，用碘化丙啶 （PI）对胃癌细胞株进行染色以流式细胞术检测实验组和对照组的细胞周 期变化，运用 Flowjo 软件分析 TRIM67 基因的与胃癌细胞细胞周期的关 系和作用。应用蛋白质印迹法对细胞周期相关蛋白 CyclinD1、CDK4、P21 和 P27 进行检测，以明确 TRIM67 对细胞周期相关蛋白的