UBE2B基因的一个新杂合突变与男性不育的关系 外科学(泌尿外)专业论文.docxVIP

安徽医 安徽医科大学硕士学位论文 PAGE PAGE 2 主要英文缩略词表(Abbreviation) 英文缩写 UBE2B 英文全名 ubiquitin-conjugating enzyme E2B 中文全名 遍在蛋白缀合酶E2B E1s Ubiquitin-activating enzymes 泛素活化酶E1 E2s Ubiquitin-conjugating enzymes 泛素结合酶E2 E3s Ubiquitin-protein ligases 泛素-蛋白连接酶E3 IA idiopathic azoospermia 特发性无精子症 SP1 specific β1 glycoprotein 特异性β1糖蛋白 DNA deoxyribonucleic acid 脱氧核糖核酸 UPS Ubiquitin Proteasome System 泛素蛋白酶系统 IVF in vitro fertilization 体外受精 ICSI Intracytoplasmic Sperm Injection 卵胞浆内单精子注射技术 IMSI Intracytoplasmic-sperm-injection 胞浆内选择性单精子注射 UTR untranslated region 非翻译区 SNP single nucleotide polymorphism 单核苷酸多态性 WT wide type 野生型 DMEM Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium 达尔伯克改良伊格培养基 h hour 小时 min minute 分钟 ml milliliter 毫升 PCR polymerase chain reaction 聚合酶链反应 CRSP cofactor required for Sp1 SP1多亚基复合物 SC synaptonemal complex 联会复合体 UBE2B 基因的一个新杂合突变与男性不育的关系 中文摘要 目的： 研究 UBE2B 基因启动子突变与男性不育的关系；探讨转录因子 SP1 对突变 后的 UBE2B 基因启动子转录活性的影响，进一步了解男性不育症的发病机制。 方法： (1) 收集 120 例特发性无精子症(IA)患者和 120 例有正常生育能力男性的血液标 本，提取 DNA：设计 4 对引物，PCR 扩增距 UBE2B 基因编码区上游 2551 bp 长 度的 5’UTR 区域和启动子，扩增产物用 ABI 3730 DNA 测序仪进行测序分析，所 发现的突变用 TRANSFAC 真核生物转录因子分析软件标记并与 dbSNP135 数据库 和 1000Genomes 数据库进行比对。 (2) 通过 TRANSFAC 真核生物转录因子分析软件分析 UBE2B 启动子，寻找与 转录因子的潜在结合位点，构建 UBE2B 启动子野生型 (UBE2BWT) 和突变体 (UBE2Bmut) 质粒，将转录因子质粒 (SP1) 分别与野生型质粒和突变体质粒共转 染 Hela 细胞和 293T 细胞，运用双荧光素酶报告基因检测突变体对转录因子转录 活性的影响，及在突变体存在的情况下，转录因子对野生型 UBE2B 启动子转录 活性的影响。 (3) 对受试的不育患者尽可能行睾丸活检术，活检睾丸组织制成石蜡切片，观 察睾丸生精情况，尤其是含有突变体的患者。 结果： (1) 对 120 例男性不育患者和 120 例正常男性的 UBE2B 基因启动子区域测序分 析，发现 8 个单核苷酸多态性位点(SNPs)，其中 4 个序列变异 (Chr.133705424 TA， Chr.133706326 AG，Chr.133706612 CT 和 Chr.133706626 TC) 已被发现，其 余 4 个新的变异 (Chr.133706771 TA，Chr.133706876 TG，Chr.133706925 AG 和 Chr.133706996 TG) 在 dbSNP135 数据库和 1000 基因组数据库中均未见诸报 道，在 120 例正常男性中也未发现这 4 种新的变异。 (2) TRANSFAC 真核生物转录因子分析软件检测新发现的 4 个 SNPs 中，有 3 种突变 (mut1 Chr.133706771 TA ， mut2 Chr.133706876 TG ，和 mut3 Chr.133706925 AG) 位于转录因子 SP1 的结合区域，双荧光素酶报告基因实验发 现 SP1 能激活 UBE2B 启动子 WT，mut1，mut2 的转录活性，不能激活 mut3 的转 录活性；当 mut3 与 WT 共转染时，SP1 对 UBE2BWT 启动子的转录活性明显下 降，提示 mut3 是通过显