UL29shRNA表达质粒与ACV对HSV-2抑制效果的比较-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

黄畅遵义 黄畅 遵义医学院硕士学位论文 万方数据 万方数据 UL29shRNA 表达质粒与 ACV 对 HSV-2 抑制效果的比较 中文摘要 目的： 针对单纯疱疹病毒Ⅱ型（Herpes simplex virus type 2, HSV-2）的 UL29 基因， 构建了 4 组短发夹 RNA（Small hairpin RNA, shRNA）表达质粒—pGPU6/GFP/Neo/ shRNA UL29，并对 UL29shRNA 表达质粒进行了筛选。通过将筛选的 UL29shRNA 表达质粒与抗病毒药物阿昔洛韦（Aciclovir, ACV）的抗病毒效果及细胞毒性进行比 较，探讨 RNA 干扰在细胞水平上对 HSV-2 病毒的抑制效果。 方法：根据 shRNA 的一般设计原则，针对 HSV-2 的 UL29 基因设计出四组表达质粒， 通过病变抑制率、mRNA 相对表达量从中筛选出一组干扰效果最好的表达质粒 —UL29-shRNA1641。以 pGPU6/GFP/Neo/UL29-shRNA1641 作为 RNA 干扰组与抗病 毒药 ACV 进行对 HSV-2 的抑制效果的比较研究。预实验中通过 CCK-8（Cell Counting Kit-8）法测定 ACV 的最大无毒浓度（maximal atoxic concentration, TC0）和 ACV 的 半数有效浓度（Half effective concentration, EC50），分别用于病毒抑制效果的实验和 细胞毒性的实验。UL29-shRNA1641 与 ACV 抑制 HSV-2 的实验分为 3 个实验组：RNAi 组、ACV 组和 RNAi+ACV 组。采用 CCK-8 法检测病变抑制率，实时荧光定量 PCR （Real-time fluorescent quantitative PCR, RT-PCR）检测 UL29mRNA 的相对表达量， Karber 法检测细胞上清液中病毒滴度的变化、蛋白印迹法（Western blot）检测 ICP8 的相对表达量，对 RNAi 与 ACV 抑制效果进行比较；通过 WST-1（Water-Soluble Tetrazolium-1）法和台盼蓝染色计数法对质粒转染复合物（质粒+转染试剂）和 ACV 的细胞毒性进行比较。 结果：（1）通过病变抑制率、mRNA 相对表达量检测表明，4 组 UL29shRNA 表达质 粒对 HSV-2 均有一定的抑制效果，以其中 UL29-shRNA1461 对基因表达抑制率最高， 为最佳干扰组。（2）预实验中 Karber 法测定扩增后的病毒滴度为 TCID50=10-5.375 /100μl，CCK-8 法测定 ACV 的 TC0 和 EC50 分别为 5.0μg/ml 和 31.7μg/ml。（3）CCK-8 法检测病变抑制率的结果显示，RNAi 组、ACV 组和 RNAi+ACV 组细胞病变抑制率 分别为 35.35±0.98%、43.95±1.31%和 85.82±1.13%，其中 RNAi 组比 ACV 组病变抑 制率低（P﹤0.05），RNAi+ACV 组的病变抑制率明显高于 RNAi 组和 ACV 组（P﹤ - 2 - 0.05）。（4）RT-PCR 检测三组 mRNA 的相对表达水平，RNAi 组、ACV 组和 RNAi+ACV 组均能不同程度降低 mRNA 相对表达量。RNAi 组 UL29 基因相对表达量高于 ACV 组（P﹤0.05）；RNAi+ACV 组 UL29 基因相对表达量明显低于 RNAi 组和 ACV 组（P ﹤0.05）。（5）Karber 法检测三组细胞上清液病毒滴度表明，阴性对照组的上清病毒 滴度为 10-5.4±0.3/100μl，RNAi 组、ACV 组和 RNAi+ACV 组上清液病毒滴度分别为 10-4.0 ±0.2/100μl、10-3.7±0.2/100μl 和 10-2.9±0.3/100μl，三组与阴性对照相比均有显著性差异（P ﹤0.05），RNAi 组病毒滴度高于 ACV 组（P﹤0.05），RNAi+ACV 组的病变病毒滴度 明显低于 RNAi 组和 ACV 组（P﹤0.05）。（6）Western blot 检测 ICP8 相对表达量， RNAi 组、ACV 组和 RNAi+ACV 组均能不同程度降低 ICP8 表达，ACV 组的 ICP8 相对表达量比 RNAi 组低（P﹤0.05）。RNAi+ACV 组 ICP8 相对表达量降低最为明显， 与 ACV 组和 RNAi 组相比有显著差异（P﹤0.05）。（7）WST-1 法对转染复合物与 ACV 的 细 胞 毒 性 进 行 比 较 ， RNAi 组 和 ACV 组 细