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TP53基因改变影响MDM2抑制剂对神经胶质瘤的效应及机制研究-药物分析学专业论文
摘 要
背景目的:
神经胶质瘤是神经系统最常见的恶性肿瘤,具有生长迅速、浸润性生长、恶性程度 高、病程短、手术后易复发、预后很差等特点,严重威胁着人民群众的健康。神经胶质 瘤发生的原因以及发生发展的机制还有很多待研究之处。肿瘤的发生发展与基因改变密 切相关,而且存在一个基因改变和病变效应的不断积累、演化的过程。而基因改变中, 癌基因和肿瘤抑制基因发挥的作用最为关键。肿瘤细胞中癌基因可以通过多种方式异常 激活,同样,抑癌基因也可以通过多种方式异常失活。同时,不同个体肿瘤又在基因改 变、药物敏感性上具有很大差异。抑癌基因 TP53 的表达产物 p53 蛋白在细胞周期的调 控、细胞基因组完整性的维持、诱发细胞分化和凋亡中起着重要的作用。p53 信号通路 在肿瘤发生发展中发挥着相当重要的作用。P53 信号通路在神经胶质瘤发生发展中也扮 演着极其关键的作用。MDM2 对 p53 蛋白水平具有重要的调控作用,而且这种调控作用 与 TP53 基因状态密切相关,因此,本研究着重探讨 MDM2 特异性小分子抑制剂 Nutlin-3 对具有不同 TP53 基因状态的神经胶质瘤的作用和机制,为 Nutlin-3 的临床应用以及神 经胶质瘤的个体化治疗提供实验依据。
实验方法:
采用 RT-PCR 方法克隆出神经胶质瘤细胞系 U87、A172 和 U251 中 TP53 基因转录 出的 cDNA,采用 DNA 测序方法确定其基因是否有改变。在此基础上,应用 Nutlin-3 处理三种细胞,使用 MTT 方法测定细胞活力,明确 Nutlin-3 对三种细胞作用的差异; 采用 MTT 法检测 Nutlin-3 联合 PI3K 抑制剂 LY294002 应用对三种胶质瘤的作用。应用 RT-PCR 定量方法确定三种细胞用药前后 p53 以及 p53 靶基因 MDM2、BAX 和 P21 mRNA 表达量的差异,应用 Western-blot 方法检测 p53 蛋白、多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(PARP) 和核增殖抗原(PCNA)用药前后量的变化,应用 Oligonucleotide pull-down 方法检测三 种细胞中 p53 蛋白的 DNA 结合活性。
实验结果:
1、克隆到的 TP53 基因 cDNA 片段经测序后确定,神经胶质瘤细胞系 U87 中 TP53
基因没有突变,属于野生型;而 A172 细胞系发生 N239S 改变,U251 细胞系发生 R273H
I
改变。
2、MTT 细胞活力测定实验显示:MDM2 抑制剂 Nutlin-3 能够明显抑制神经胶质瘤 细胞 U87(25 μM,抑制率为 36.97%)、A172(25 μM,61.41%)的生长,而对 U251
(25 μM,﹣18.27%)细胞没有明显作用;PI3K 抑制剂 LY294002 对三种胶质瘤细胞在 较高浓度下均有作用;Nutlin-3 联合 LY294002 处理,抑制神经胶质瘤细胞生长作用明 显强于单独使用 Nutlin-3 或 LY294002。
3、RT-PCR 半定量实验显示:使用 Nutlin-3 处理前后,神经胶质瘤 U251 细胞 p53 mRNA 表达水平没有明显变化,而处理后 U87、A172 细胞中 p53 mRNA 表达水平显著 升高(p0.01);用药处理前后,U251 细胞中 p53 靶基因 P21 和 BAX mRNA 表达水平 没有太大变化,MDM2 基因 mRNA 表达水平略有升高,但没有统计学意义。而处理后 U87 细胞中 p53 靶基因 MDM2,P21 和 BAX mRNA 表达水平明显升高(p0.05);A172 细胞中 p53 靶基因 MDM2,P21 mRNA 表达水平显著升高(p0.01),BAX mRNA 表达 水平明显升高(p0.05)。
4、Western-blot 实验表明:无药物处理时,神经胶质瘤 U251 细胞中 p53 蛋白水平 显著高于 U87 和 A172 细胞(p0.01);Nutlin-3 处理后,U251 细胞中 p53 蛋白水平略 有提高但没有统计学意义。而用药处理后 U87、A172 细胞中 p53 蛋白水平显著升高
(p0.01),A172 细胞升高尤其显著;药物处理后,细胞凋亡标志蛋白 PARP 在 U87 和 U251 细胞中没有明显变化,而在 A172 细胞中检测到少量 caspase 切割后片段;细胞增 殖标志蛋白 PCNA 在 U251 和 A172 细胞中的水平没有明显变化,而在 U87 细胞中显著 降低(p0.01)。
5、Oligonucleotide pull-down 实验显示:U87 细胞中野生型 p53 能够结合特定 DNA 序列,而且 A172 细胞中 N239S 改
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