β 葡萄糖苷酶的制备以及对人参皂苷的酶法转化-药理学专业论文.docx

I I 三峡大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究 工作所取得的成果，除文中已经注明引用的内容外，本论文不含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体均 已在文中以明确方式标明，本人完全意识到本声明的法律后果由本人承担。 学位论文作者签名： 日 期： II II 内 容 摘 要 目的: 本实验通过 Aspergillus 固态发酵，分离纯化制备β-葡萄糖苷酶，并利 用β-葡萄糖苷酶催化人参皂苷和 N-乙酰葡萄糖胺，形成新的氨基糖皂苷，从而 期望获得高效低毒的新型人参皂苷，为皂苷生物转化研究提供新的方向和思路。 方 法 : 首 先 ， 将 Aspergillus 发 酵 所 得 的 粗 酶 分 别 经 过 Sephadex-G150 和 DEAE-Sephadex-A50 分离纯化，获得较纯的β-葡萄糖苷酶。其次，将新鲜人参 切片，洗净，在 50℃烘干，粉碎。分别用 70%的乙醇回流提取，乙酸乙酯和正丁 醇萃取。正丁醇萃取部分经 D101 大孔树脂的纯化，真空冷冻干燥后得到人参总 皂苷。第三，将人参皂苷、N-乙酰葡萄糖胺和β-葡萄糖苷酶按照以下三种添加 方式进行反应：第一组，将人参皂苷、N-乙酰葡萄糖胺和β-葡萄糖苷酶同时放 入；第二组，先加入人参皂苷和β-葡萄糖苷酶，后加入 N-乙酰葡萄糖胺继续反 应；第三组，先加入 N-乙酰葡萄糖胺和β-葡萄糖苷酶，后加入人参皂苷。再次， 将转化总产物经过 ODS-C18 反相硅胶分离纯化，得到的各部分转化产物同人参总 皂苷和总转化产物进行体外抗肿瘤活性评价。 结 果 ： 从 Aspergillus 发 酵 得 到 的 β - 葡 萄 糖 苷 酶 经 Sephadex-G150 和 DEAE-Sephadex-A50 分离纯化后，最终通过 SDS测定去分子量为 97.5KD 左 右，较原粗酶纯化了 26.84 倍，说明β-葡萄糖苷酶已经得到较好的分离。三种 转化方式通过 ESI-MS 分析，第二种转化方法最好。在 33min 对应的质谱为[M+Na]+ 979.9， [M+K]+995.6，推测其分子量为 957.6，发生氨基糖的酶催化反应。通过 第二种转化方式进行放大实验，获得的总转化产物经 ODS-C18 反相硅胶分离后得 到 35%(甲醇)、35%(乙腈)、45%(乙腈)和 55%(乙腈)四部分转化产物。将这四种 转化产物和人参总皂苷和总转化产物进行 HepG2 肝癌细胞和 caski 宫颈癌细胞体 外抗肿瘤活性实验比较，其中 55%转化产物的抗肿瘤活性为显著。当其浓度为 100 μg/ml 时对 HepG2 肝癌细胞和 caski 宫颈癌细胞的抑制率分别为 41%和 46.89%。 结论：β-葡萄糖苷酶能在一定的条件下催化人参皂苷和 N-乙酰葡萄糖胺发生转 化反应。但只有第二种工艺发生了 N-乙酰氨基葡萄糖和葡萄糖的转移反应，所 得到的新的 N-乙酰氨基糖代皂苷化合物转化率较高，第一种工艺和第三种工艺 主要发生的β-葡萄糖苷酶的酶水解反应。 第二种转化方式的得到的转化产物的 体外抗肿瘤活性与总皂苷和转化总产物有所提高，尤其是 55%转化产物随着浓度 的升高，抗肿瘤活性增强。 关键词：人参皂苷 β-葡萄糖苷酶 酶法转化 氨基皂苷 PAGE PAGE III Abstract Objection ： This experiment We use β -glycosidase fermentatied and purified from Aspergillus to catalytic ginseng saponins and N - acetyl glucosamine to make its formed new glycosidase bond. so as to achieve risk-benefit ratio of new ginseng saponins. These have provide new direction and thinking for saponins biotransformations. β-glycosidase was prepared by the solid-state fermentation，separ- -ation and purification from Aspergillus. The new amino-saponins were formed through the catalysis of ginseng saponins and N - acetyl glucosamine by the β-glycosidase so