γ-H2AX、pATM在潮汕贲门癌中的表达及意义 病理学与病理生理学专业论文.docxVIP

汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 汕头大学医学院硕士学位论文 中文摘要 背景和目的 潮汕地区是贲门癌（Gastric Cardia Cancer, GCA）高发区之一，研究发现幽门螺杆菌 （Helicobacter pylori, H.pylori）感染与贲门慢性炎症有关，而慢性炎症中产生的活性氧 和活性氮片段（Reactive O xygen and N itrogen Species, RONS）以及前列腺素可以通过直 接或间接的途径对 DNA 造成损伤。其中环氧合酶 2（Cyclooxygenase 2, COX-2）是催化 花生四烯酸生成前列腺素的关键酶。 DNA 双链断裂（Double-Strand Breaks, DSBs）是最严重的 DNA 损伤类型。DSBs 发生后，损伤位点的 MRN 复合物（MRE11, NBS1, RAD50）解开 DN A 双链，将毛细血 管共济失调突变蛋白（Ataxia Telangiectasia Mutated, ATM）募集到损伤位点。通过与 MRN 的相互作用，ATM 单体化并自动磷酸化 Ser1981 位点，形成 pATM（Phosphorylation of ATM），pATM 进一步使得组蛋白 H2A 家族成员 X（H2A histone family, member X, H2AX）的 Ser139 位点被磷酸化形成 γ-H2AX（Phosphorylation of H2AX）焦点，γ-H2AX 焦点在 10-30min 达到高峰，pATM 在损伤后 17min 也可以达到高峰，所以，pATM 和 γ-H2AX 在损伤位点的共表达对于 DSBs 的检测具有重要的意义。γ-H2AX 焦点的形成为 DNA 损伤修复蛋白的募集提供了一个平台，pATM 会继续磷酸化下游的 p53 蛋白，发挥 细胞周期关卡的作用，使细胞周期停滞在特殊的阶段，为 DNA 修复赢得时间。但是， p53 蛋白在肿瘤中很容易发生突变，导致 DSBs 修复失败。所以，DSBs 不仅是最严重的 DNA 损伤类型，也是最难修复，并且是最容易引起细胞突变的损伤类型。在许多类型的 肿瘤中发现了 DSBs，表明 DSBs 与肿瘤存在着密切的关系。但是，目前，DSBs 在贲门 癌中的检测尚没有报道，并且在贲门癌中研究炎症介质 COX-2 与 DSBs 的关系也属首次。 本实验主要通过免疫组化 Envision 二步法检测 γ-H2AX、pATM、pp53、COX-2 在 贲门癌手术切除标本不同部位的表达情况，来探讨贲门癌和 DSBs 的关系；通过对贲门 癌及周边组织进行炎症分级，探讨炎症与 DSBs 的关系。 材料和方法 I PAGE PAGE IV III III 材料 搜集 2010-2012 年间汕头大学医学院附属肿瘤医院术前无放化疗的贲门癌配对标本 150 例。分别在每例的癌组织、距离癌组织 1-2cm 处的癌旁组织、近切缘组织三个部位 中，每个部位取两份样本：一份用来做石蜡切片，一份用来提取蛋白，做 Western blotting。 方法 HE 染色 组织学分型及炎症程度的分级 免疫组化 Envision 二步法染色 检测 γ-H2AX、pATM、pp53、COX-2 蛋白的表达情况 3. 图像分析法 应用 Leica IM50 图像采集系统和 Image-Pro Plus 6.0 图像分析系统对 γ-H2AX、pATM、 pp53 染色结果进行分析，计算每张切片的阳性标记指数 (Labelling Index, LI)；对 COX-2 染色结果进行分析，测量每张切片的积分光密度（Intergral Optical Density, IOD）。 4. 统计分析 应用 SPSS15.0 对统计结果进行分析，多个均数之间的比较采用单因素方差分析 （One-Way ANOVA），两个均数之间的比较采用 T 检验；不服从正态分布的数据采用非 参数检验；相关性分析采用 Pearson 相关分析（Pearson correlation analysis），炎症和瘤变 等级的分布差异采用卡方检验。显著性标准定位：P＜0.05 为差异有统计学意义，P＜0.01 为差异有高度统计学意义。 5. Western blotting 检测 γ-H2AX 蛋白在贲门癌、癌旁和近切缘组织中的表达情况。 6. Simple 同部位标记和消除抗体法 检测 γ-H2AX、pATM、pp53、COX-2 的共表达。 结果： 1. γ-H2AX、pATM、pp53 在近切缘组织（N）、癌旁组织（P）、癌组织（CA）中均 有阳性表达，且表达率呈现逐渐递增的趋势：N＜P＜