αν和β1整合素通过FAK信号通路介导了Aβ对海马神经元的神经毒性作用-神经病学专业论文.docxVIP

华 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 中文摘要 第一部分 原代大鼠海马神经元培养、鉴定及 Aβ 神经毒性模型的建立 目的 分离培养原代大鼠海马神经元并鉴定其纯度，建立 Aβ 体外神经毒性模型。 方法 参照文献方法分离出生 1d SD 乳鼠海马并体外培养神经元细胞，利用 MAP-2 免疫染色鉴定神经元细胞纯度。不同浓度老化的纤维化 Aβ 在不同时间点干预 细胞，利用 MTT 比色法测定其细胞活性，寻找建立 Aβ 体外神经毒性模型最 佳的时间点和浓度、 结果 分离后细胞表现为典型的神经元形态，且经 MAP-2 染色显示分离细胞纯度＞ 95%，可用于后续的实验。老化的纤维化 Aβ 神经毒性呈现干预时间和浓度依赖 性，10 μM Aβ 干预 3 d 时细胞存活率为正常组细胞存活率的 62.3%，处理 4 d 时 细胞存活率为正常组细胞存活率的 46.9%。 结论 参照文献方法可成功分离并培养原代海马细胞。Aβ 神经毒性呈现时间和浓度 依赖性，基于整体实验考虑，选定 10μM Aβ 处理海马神经元 3 d 作为后续实验 的造模方法。 关键词 原代海马神经元培养；纯度鉴定；神经毒性模型 第二部分 慢病毒载体靶向沉默原代大鼠海马神经元 FAK 表达 siRNA 的筛选 目的 针对黏着斑激酶（focal adhension kinase, FAK）基因 PtK2 制备靶向性 RNAi 慢 病毒载体，包装后测定病毒浓度并转染大鼠原代海马神经元细胞，筛选最佳的 感染条件和沉默靶点序列。 方法 依据 siRN A 原理设计 3 条大鼠海马神经元 FAK 基因 PtK2 的靶向性 siRN A 序 列（S1, S2, S3），经酶切、转化、PCR 鉴定、阳性克隆测序并慢病毒包装、测定 病毒浓度。利用荧光显微镜观察各组细胞 GFP 表达测定不同条件下慢病毒转染 效率，Real-time PCR 检测神经元细胞 FAK 基因表达，Western blot 检测 FAK 蛋白表达。 结果 成功制备 3 条靶向性 FAK 基因 PtK2 的 siRNA 慢病毒载体并成功转染到大鼠 海马神经元细胞中，在感染复数为 10 并加入 5 μg/ml polybrene 条件下慢病毒感 染率达到 90%以上。S1、S2、S3 均可抑制 FAK 基因及蛋白的表达，但 S1 沉默 效果最佳，敲除效率可达到 65%，与正常组比较有均有统计学差异（P0.05）。 结论 筛选出最佳的感染条件及最佳沉默靶向性序列 S1，为后续研究整合素在 AD 发 病中的机制提供了前期实验基础。 关键词 siRNA; 黏着斑激酶；海马神经元 第三部分 αν 和 β1 整合素介导 Aβ 对海马神经元的 神经毒性作用及可能机制探讨 目的 探讨 αν 和 β1 整合素介导 Aβ 对海马神经元的神经毒性作用及可能的作用机制。 方法 1）在 10 μM Aβ 处理细胞前，分别用 2.5 μg/mL 和 5 μg/mL 的 αν 和 β1 整合素 的特异性拮抗剂 17E6 和 ab58524 预处理细胞 42 h，并通过 MTT、流式细胞 计数、TUNNEL 染色等方法观察各组神经元细胞凋亡变化; 2）利用 siRNA 技术沉默黏着斑蛋白（focal adhension protein, FAK），选取最佳 的沉默靶序列 T1 并 MOI 为 10 并加入转染增强剂 5μg/mL polybrene 的条件，转 染干预各组细胞并观察各组细胞的凋亡变化； 3） 通过 real-time PCR 和 Western blotting 方法测定各组细胞 FAK、ρFAK 的基 因和蛋白表达情况，探讨 αν 和 β1 整合素介导 Aβ 对元代培养海马神经元凋亡 的可能机制和信号通路。 结果 1）MTT 结果显示，17E6 和 ab58524 均可增加 Aβ 诱导的海马神经元的存活 率，与 Aβ 处理组比较有显著差别（分别为 P0.01， P0.05）,而 siFAK 后， 17E6 和 ab58524 的神经保护作用明显减弱； 2）TUN EL 染色及流失细胞计数法显示，17E6 和 ab58524 可抑制 Aβ 诱导的 海马神经元的凋亡，与 Aβ 处理组比较有显著差别（P0.05），而 siFAK 后，17E6 和 ab58524 的神经保护作用明显减弱； 3）Aβ 处理均可增加 FAK 蛋白和基因表达，而 17E6、ab58524 预处理后 FAK 基因和蛋白表达水平下降，可其磷酸化 FAK 蛋白表达水平却升高。siFAK 后， 细胞 FAK 及磷酸化 FAK 基因、蛋白表达水平均明显下降（P0.05）。 结论 αν 及 β1