β 萘黄酮细胞特异性影响大鼠GCLC基因表达-生物化学与分子生物学专业论文.docxVIP

广州医学院硕士学位论文β－萘黄酮细胞特异性影响大鼠 广州医学院硕士学位论文 β－萘黄酮细胞特异性影响大鼠 GCLC 基因表达 PAGE PAGE 10 目 的 在于研究外界刺激因子 β-NF 在作用浓度范围内对 GCLC 基因在大鼠 RTE 细胞 和 H4ⅡE 细胞中差异性表达的影响，从而了解 β-NF 调控 γ-GCS 基因转录调节机制。 方 法 1、刺激因子的筛选：将 GCLC 基因上游调控序列驱动的 GCLC-PGL3-enhancer- Luciferase 报道载体与 PRL-sv40 海肾荧光素酶内参表达质粒分别共转染大鼠支气管 上皮细胞(RTE)、大鼠肝癌细胞（H4ⅡE）细胞。待转染 12h 后，将 Bap ，TNF-α， GSH ，GSSG ，Cysteamine ，Cystamine，β-NF，α-NF 按照所需浓度梯度刺激细胞 12h，同时设定 DMSO 空白对照组。将每种刺激因子在不同浓度作用下的标准化荧 光素酶活性值与标准化空白对照组荧光素酶活性值做比较，筛选出对上述两细胞都 发挥调控效应的刺激因子及作用浓度。 2、荧光定量PCR检测：分别比较RTE细胞和H4ⅡE细胞中，β-NF实验组相对于 DMSO空白对照组γ-GCS的mRNA变化倍数。 3、确定刺激因子作用区间：转染大鼠GCLC基因5’上游调控序列启动子区域内r 系列缺失载体，12h后添加刺激因子，同时设定空白对照组。检测荧光素酶活性值同 上。 4、作用区间内报道载体的构建及转染：点突变NF-κB/AP-1核心元件报道载体的 构建是以GCLC-luc ( -1758~+2) 为模板，按照引物导入核心序列突变的方法，通过两 次PCR扩增出突变-380~-375和-357~-352的NF-κB/AP-1元件的片段。2种PCR产物胶回 收后连入pGEM-T easy载体，以Sac I/Xho I双酶切插入PGL3-enhancer载体鉴定并测 序。转染步骤同3。 5、刺激因子作用下激酶信号转导通路的筛选：两种细胞培养传代，分别接种于 48孔细胞培养板中，12h后添加激酶抑制剂（SB-202358、kenpaullone、k-252a），设 定空白对照组。转染步骤同3。 6、免疫蛋白印迹(Western Blot)方法检测刺激因子作用下细胞内γ-GCS蛋白、 GSK-3β蛋白表达水平。 结 果 1、转染GCLC-luc到大鼠支气管上皮细胞(RTE) 和大鼠肝癌细胞（H4ⅡE），12h 后添加不同浓度梯度的各刺激因子。在两种细胞中，β-NF（1～100uM）对GCLC基 因表达均具有调控作用，而其他刺激因子在各个浓度梯度范围内没有影响GCLC基因 的表达。在大鼠支气管上皮细胞(RTE)，β-NF（1 uM，10 uM ，100uM）刺激后GCLC-luc 在细胞内萤光素酶活性水平较DMSO空白对照组分别下降了1.61、9.43、16.44倍（P ＜0.01）。在大鼠肝癌细胞（H4ⅡE），β-NF（1 uM，10 uM ，100uM）刺激后GCLC-luc 在细胞内萤光素酶活性水平较DMSO空白对照组上升了1.55、3.73、3.83倍（P＜0.05）。 β-NF（1～100uM）对RTE细胞GCLC基因表达有剂量依赖性抑制作用，对H4ⅡE细 胞GCLC基因表达有剂量依赖性上调作用。 2、β-NF 刺激改变细胞内源性 γ-GCS 的 mRNA 水平，在大鼠支气管上皮细胞(RTE) 中，实验组 γ-GCS 的 mRNA 表达量是空白对照组的 2-0.4 倍（P＜0.05）。在大鼠肝 癌细胞（H4ⅡE）中，实验组 γ-GCS 的 mRNA 表达量是空白对照组的 21.03 倍（P＜ 0.05）。β-NF（10uM）在转录水平影响两种细胞内源性 γ-GCS 基因的表达。在 RTE 细胞中的抑制，以及在 H4ⅡE 细胞中的促进表达作用。 3、将 GCLC 基因 5’上游调控序列启动子区域内 r 系列缺失载体分别转染两种 细胞，在大鼠支气管上皮细胞(RTE)中，转染 GCLCL-luc、5r、2r、8r、11r、12r、15a 载体，处理组荧光素值较空白对照组荧光素均依次下降了 7.84、15.82、12.74、11.02、 16.44 、10.33、12.22 倍（P＜0.01），大鼠肝癌细胞（H4ⅡE）中均依次上升了 1.82、 1.58、1.86、1.59、2.53、2.82、2.41 倍（P＜0.05）。（-1780bp～-390bp）区间内，两 种细胞处理组荧光素值与空白对照组荧光素均差异显著。说明 β-NF 在这一区间并没 有作用位点，从 β-NF 依旧影响 GCLC 基因的表达，可能作用位点在 15a 之后的区间 即（-390bp～+2bp）。 4