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水稻秸秆降解菌系筛选及其菌群组成分析 　　摘要：将崩解滤纸能力强的菌系1在30 ℃条件下以水稻秸秆为唯一碳源连续驯化41代，25代后羧甲基纤维素钠（CMC）酶活力、滤纸酶活力和秸秆失重率基本稳定，较第1代提高了59.7%、61.0%和62.4%。利用PCR-DGGE对驯化进程中菌系1细菌组成多样性及优势菌群的变化动态进行分析，原始样品共检测到13个主要条带，优势菌群由Solitalea sp.、假单胞菌属（Pseudomonas sp.）和一些不可培养微生物组成。经滤纸及水稻秸秆驯化，部分细菌被淘汰，微生物多样性减少，滤纸和水稻秸秆驯化稳定期优势菌群均包括多形拟杆菌属（Bacteroides sp.）、梭菌属（Clostridium sp.）和假单胞菌属，表明这些优势菌群对滤纸纤维素和水稻秸秆纤维素均有较强的降解能力，此外，条带10（Uncultured Clostridium sp. Clone 3-2）在水稻秸秆驯化33代颜色变深成为优势菌，推测在水稻秸秆降解过程中具有一定的作用。 　　关键词：菌系1；驯化；水稻秸秆；变性梯度凝胶电泳；多样性；优势菌群 　　中图分类号： X172文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）08-0257-04 　　2013年黑龙江省水稻秸秆量为2 400万t，约占秸秆总量的39.3%[1]。由于水稻秸秆木质素缩聚单元比例较高，与纤维素和半纤维素结合较紧密，硅质化程度高[2]，同时黑龙江年均气温较低，因此其自然降解速度缓慢，资源化利用率低，大量焚烧严重污染环境。 　　近年来国内外学者选育出一些能够降解水稻秸秆的菌株，主要包括木霉菌、青霉菌和一些细菌，但是，研究发现单菌株产酶能力有限[3]，且水稻秸秆结构复杂，很难被高效降解，而菌系通过多种微生物协同作用对水稻秸秆降解效果更好，然而，目前对菌系的研究较少。本试验在30 ℃下以6种不同来源的样品为菌源，采用限制性筛选的方法，利用水稻秸秆定向驯化培养，获得能够高效稳定降解水稻秸秆的菌系，并通过分子生物学技术揭示该菌系细菌组成多样性及优势菌群的变化动态。 　　1材料与方法 　　1.1样品来源（表1） 　　1.2培养基 　　富集培养液[4]：蛋白胨5 g，酵母粉1 g，NaCl 5 g，CaCO3 2 g，微量元素液0.5 mL，土壤浸汁100 mL，蒸馏水900 mL，121 ℃灭菌30 min。 　　微量元素溶液成分：ZnSO4 0.29 g，CaCl2 0.24 g，CuSO4 025 g，MgSO4 0.17 g。 　　土壤浸汁：土壤与去离子水以质量比1 ∶1，搅拌混合，过滤，灭菌后备用。 　　蛋白胨纤维素培养液（PCS）[5]：蛋白胨5.0 g，纤维素（新华滤纸/水稻秸秆）5.0 g，NaCl 5.0 g，CaCO3 2.0 g，酵母粉 1.0 g，蒸馏水1.0 L，121 ℃灭菌30 min。1.3试剂 　　EDTA（乙二胺四乙酸）、SDS（十二烷基磺酸钠）、CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）、磷酸二氢钠、异丙醇、蛋白酶K、磷酸氢二钠、异戊醇、溶菌酶、Tris-饱和酚、甲叉双丙烯酰胺、丙烯酰胺、去离子甲酰胺、尿素、冰乙酸、过硫酸铵、DNA胶回收试剂盒，试剂均为分析纯。 　　DNA提取液的配制[6]：0.1 mol/L Tris-HCl，0.1 mol/L EDTA，0.1 mol/L Na3PO4，1.5 mol/L NaCl，1% CTAB，pH值为8.0。 　　1.4试验方法 　　1.4.1样品富集称取1～6号样品各10 g，分?e加入 150 mL 富集培养液中，30 ℃恒温振荡培养，富集3代，10 d/代，传代接种量为15%。 　　1.4.2菌系初筛采用滤纸条崩解法，向150 mL蛋白胨纤维素培养基（滤纸）中接入20 mL富集培养液，30 ℃静置培养，驯化5代，10 d/代，选择滤纸崩解的样品，继续多代驯化。 　　1.4.3菌系复筛待菌系降解滤纸能力稳定后，采用蛋白胨纤维素培养基（水稻秸秆）继续定向驯化培养，第4天测定CMC酶活及滤纸酶活，第7天测定样品中秸秆失重率。 　　1.4.4纤维素酶活性测定采用DNS法[7]测定CMC酶活性和滤纸酶活性。 　　1.4.5秸秆失重率测定将水稻秸秆发酵液离心，弃上清，加入盐酸和硝酸混合液，过滤，再用蒸馏水反复冲洗，将剩余物转入培养皿，于105 ℃电热恒温鼓风干燥箱中烘干至恒质量，称质量。按照公式计算失重率[8]。 　　失重率ω=[（m1-m2）/m0]×100%。 　　其中，m0为水稻秸秆初始质量（g），m1为培养皿与样品烘干恒质量（g），m2为培养皿质量（g） 　　1.4.6菌系DNA提取及PCR-DGGE分析 　　1.4.6.1菌系