小檗碱与牛血清白蛋白相互作用核磁共振研究.docVIP

小檗碱与牛血清白蛋白相互作用核磁共振研究 　　DOI： 10.3724/SP.J.1096.2011.01223 　　 　　 　　1（温州医学院药学院， 温州 325035）2（中科院上海药物研究所新药研究国家重点实验室， 上海 201203） 　　 　　摘 要 采用核磁共振波谱技术（NMR）研究小檗碱与牛血清白蛋白（BSA）的相互结合作用。比较不同浓度小檗碱在一定浓度的BSA溶液中的化学位移、弛豫时间和扩散系数的变化情况。研究表明，小檗碱环上芳香质子与BSA的结合作用较强，其它烷基质子与BSA结合作用较弱；BSA的结合使得小檗碱各个质子的1H T1弛豫时间明显减少，质子在溶液中运动受限；小檗碱与BSA相互作用的饱和浓度之比为60∶1；根据自扩散系数拟合可以得到两者解离常数为0.44 mmol/L； 结合位点数为22。本研究为临床安全、合理使用小檗碱，以及开发改良小檗碱类似药物提供实验依据。 　　 　　关键词 核磁共振； 小檗碱； 牛血清白蛋白； 弛豫时间； 自扩散系数 　　 　　 　　 　　 2010-11-08收稿；2011-01-13接受 　　本文系国家自然科学基金（No和浙江省医药卫生专项（No.2010QNA016）资助 　　* E-mail: gaohc27@ 　　 　　 　　 　　1 引 言 　　小檗碱（俗称黄连素），是主要存在于小檗科、罂粟科、毛茛科和防己科等植物中的异喹啉类生物碱。临床上常用作抗菌药，疗效显著。随着近些年的深入研究，发现小檗碱在抗炎、抗肿瘤、降血糖以及治疗心血管系统疾病方面都有显著作用［1］。血清白蛋白是血浆中含量最丰富的蛋白质，是血液总渗透压的主要调节物质。它的另一作用是在血液循环中作为许多内源性和外源性的仓储及转运分子，能与代谢物、微生物、金属离子及药物等分子结合［2］。研究药物与血清白蛋白的结合过程，有助于了解药物在体内的转运及代谢过程，有利于药物的开发研究与临床使用。 　　目前，研究药物与血清白蛋白相互作用的手段主要有光谱法、毛细管电泳法、平衡透析法和核磁共振技术［3］。徐倩等［4］利用荧光光谱法和分子以接研究了4种黄酮与BSA的相互作用，确定了它们之间的结合常数和结合位点。吴鸿伟等［5］采用毛细管电泳技术，研究了盐酸普罗帕酮与人血清白蛋白的结合作用机制。随着NMR技术的不断发展，应用NMR研究药物与蛋白的结合作用逐渐受到关注。与其它方法相比，NMR具有独特优点，如样品预处理简单、非侵入性、重复性好等；此外，它不仅能提供药物和血清白蛋白的结合部位和结合强度信息，而且还能通过弛豫时间等核磁参数得到药物与蛋白结合的动力学及空间构象变化情况等。 　　赵长春等［6］利用紫外和荧光光谱技术研究了小檗碱与人血清白蛋白的相互作用机制。曾晓蕾等［7］通过色谱法研究了盐酸小檗碱与BSA的结合作用，得到了结合常数等信息。然而，小檗碱与血清白蛋白结合的结构特征及结合位点数至今还不清楚，其结合动力学还需进一步研究。本研究采用NMR研究小檗碱与BSA的相互作用，通过小檗碱化学位移和弛豫时间的变化情况阐述BSA与小檗碱相互作用的结构特征；根据小檗碱自扩散系数求得小檗碱对BSA的表观解离常数Kd及结合位点数n，从而明确了小檗碱与BSA结合的强度及结合部位等信息。 　　 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Bruker AVANCEIII 600型高分辨核磁共振谱仪（瑞士 Bruker公司）；AB135-S/FACT型电子分析天平（瑞士 Mettler Toledo公司）；酸度计（瑞士 Mettler Toledo公司）。 小檗碱（纯度＞98%，Sigma公司）、牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；D2O（99.9%氘代，剑桥同位素实验室）；固体NaH2PO4和Na2HPO4（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；纯水由Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）制备。 　　2.2 实验方法 　　2.2.1 样品制备 配制0.2 mmol/L BSA-磷酸盐缓冲液（pH 7.4），分别与不同浓度的小檗碱混合，配制成含小檗碱与BSA摩尔浓度比分别为10∶1，20∶1，30∶1，40∶1，60∶1，80∶1，100∶1和160∶1的混合溶液，分别加10%重水锁场，加TSP定标。另外配制含2 mmol/L 小檗碱磷酸盐缓冲液（pH 7.4）作为小檗碱1H NMR谱的结构归属, 所配溶液分别装入5 mm核磁管进行NMR实验。 　　2.2.2 NMR实验 NMR实验均在质子频率为600.13 MHz的Bruker AVANCE III 600型高分辨NMR谱仪上完成的，实验温度控制在298.0 K。1H NMR谱采用90°脉冲序