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常规SNPs―PCR在水稻遗传多样性研究中应用 　　摘要：探索常规SNPs-PCR在生物遗传多样性分析中的应用。利用5个功能基因的SNP标记和11对SSR标记，对112份陕西省水稻种质资源进行聚类分析。5个SNP标记聚类分析结果基本符合材料的亲缘关系，11对SSR标记聚类结果更接近材料的系谱来源。在样本量小时，可以利用常规SNPs-PCR分析生物的遗传多样性，样本量大时，测序技术分析更方便和准确。 　　关键词：SNPs-PCR；遗传多样性；SNP标记；SSR标记；水稻 　　中图分类号： S511.032 文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）09-0028-04 　　发生在基因组DNA水平上的碱基的转换/颠换、插入/缺失及重排等变化导致了生物个体之间的差异，由此产生了RFLP、RAPD、SSR和SNP等分子标记技术，从DNA水平上来分析各种变异。SNP（single nucleotide polymorphism，简称SNP）即单核苷酸多态性，属于第三代分子标记，是许多物种基因组中最常见的变异形式，在基因组中的分布频率很高。近年来，SNPs在人类、拟南芥、大麦、大豆和玉米等多个物种中的高密度分布已有报道[1-7]。2002年，发表了水稻籼、粳2个亚种的基因组序列草图[8]，2005年又发表了水稻基因组序列全图，至此已完成全长389 Mb的水稻全基因组序列95%以上的测序工作[9]。研究发现在水稻基因组中大约每几百bp[10-14]甚至几十bp就有1个SNP[15]，表明水稻基因组中存在大量的SNP，SNP已经应用在水稻图位克隆、功能基因检测、辅助育种选择等方面[16-18]。作为第二代分子标记的代表SSR（simple sequence repeat）即简单序列重复，在真核生物基因组中大约每隔10～50 kb就存在1个SSR，在生物的遗传多样性研究中利用最广，特别是水稻、油菜、玉米等植物在品种鉴定、新品种保护等DNA指纹图谱检测中都用SSR标记[19-23]。在生物的遗传多样性分析中，从理论上讲，检测位点越多，和实际越符合，闫双勇等利用水稻数据库多态性，搜索了与水稻抽穗期候选基因有关的820个SNPs，分析了它们的多样性[24]。王佳媛等以采自四川南部麻咪泽和美姑大风顶2个自然保护区的29份野生凹叶木兰为材料，运用在PCR和测序基础上的SNPs分子标记技术对凹叶木兰的遗传多样性进行了初步分析[25]。王文斌等利用2 846个高质量的SNPs标记，对31份玉米自交系材料进行了遗传多样性分析[26]。Aslam等对32羽来自不同种群的火鸡用549万个SNPs分析了不同种群火鸡的遗传多样性[27]。也有将其他分子标记和功能SNP标记结合进行遗传多样性研究，van Inghelandt等用8 244 个SNPs标记和359个SSR标记分别对1 537个玉米自交系进行群体结构和多样性分析，得到了基本一致的聚类结果[28]。陈蓉等利用110对SRAP引物和1对影响穿心莲内酯生物合成的关键限速酶CPS内部存在的1个SNP位点对103份穿心莲样品进行遗传多样性分析[29]。上述这些结果一般都是基于测序得到的大量SNP数据进行分析，不适合于普通实验室利用，本研究利用常规SNPs-PCR 技术，参考SSR标记对相同供试材料进行遗传多样性分析，探索常规SNPs-PCR在生物遗传多样性分析中的应用。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　供试的112个水稻材料（表1）由陕西省水稻研究所提供。 　　1.2 方法 　　1.2.1 基因组提取及PCR 水稻基因组DNA采用SDS法提取，并采用1%的琼脂糖凝胶检测基因组DNA的质量。 　　PCR反应体系为：2×Taq Master Mix 15 μL，10 μmol/L的正反引物各1 μL，DNA模板1 μL，反应总体积30 μL，用ddH2O补足。反应程序为：94.0 ℃预变性5 min；94.0 ℃变性50 s，x ℃（视不同引物而定）退火50 s，72.0 ℃延伸1 min，35个循环；最后72.0 ℃ 延伸10 min，4 ℃保存；8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离PCR产物，银染法显色拍照。 　　1.2.2 引物设计 本研究所用的5个功能基因的SNP标记，包括4个抗稻瘟病基因位点和1个蜡质基因位点（Pigm、Pi9、Pita、Pib和Wx）。SSR引物为国家水稻数据中心网站分子标记中与育性恢复基因连锁的11对RM*标记[30]。引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成。 　　1.2.3 数据处理 SSR标记扩增统计条带时，电泳图谱中每条扩增带代表引物的1对结合位点，且被视为有效的分子标记。每对引物检测到的每条多态性带视为1个等位变异，将电泳图谱中的