竹荪多糖对人肝癌细胞hcc-lm3抑制作用的实验研究-experimental study on inhibitory effect of dictyophora indusiata polysaccharides on hcc - lm3 cells.docxVIP

PAGE PAGE 2 竹荪多糖对人肝癌细胞 HCC-LM3 抑制作用的实验研究 贵阳医学院公共卫生学院卫生毒理学 硕士研究生：肖佳艳 导 师: 罗鹏 教授 摘 要 目的： 研究竹荪多糖对人肝癌细胞株 HCC-LM3 细胞生长抑制情况及对细胞周 期、凋亡及凋亡相关基因 mRNA 和蛋白表达的影响，初步探讨竹荪多糖 对 HCC-LM3 细胞生长影响的作用机制，为竹荪多糖的开发利用提供实 验依据。 方法： 采用细胞增殖-毒性检测试剂盒（CCK-8）检测 0.5、1、2、4mg/ml 浓度 的竹荪多糖作用人肝癌细胞 HCC-LM3，不同时间段细胞增殖活力的变 化，计算生长抑制率；采用流式 PI 单染法和 Annexin V-FITC/PI 双染法 检测 HCC-LM3 细胞经 2.5mg/ml 竹荪多糖孵育 24h，48h，72h 后，细胞 周期和细胞凋亡的变化情况；采用 RT-qPCR 和 Western-Blot 检测竹荪多 糖孵育 HCC-LM3 细胞 48h 后细胞凋亡相关基因在 mRNA 和蛋白水平表 达的变化。 结果： 1. HCC-LM3 细胞经竹荪多糖处理后增殖活力随着时间延长和剂量增加 逐渐下降，细胞生长抑制率与作用时间和剂量存在依赖性，三个时间段 的 IC50 分别为 3.713mg/m（l 24h）、2.409 mg/m（l 48h）、1.863 mg/m（l 72h）。 2.竹荪多糖干预后，HCC-LM3 细胞周期发生改变，不同时间段细胞 G2/M 期阻滞不同，随时间的延长阻滞效果增强。 3. HCC-LM3 细胞经竹荪多糖干预后出现凋亡，72h 凋亡率为 33.49%， 早期凋多于晚期凋亡； 4. RT-qPCR 检测显示经 2.5mg/ml 竹荪多糖处理 HCC-LM3 细胞 48h 后 凋亡相关基因 Bax、Caspase-3 mRNA 表达量增加，Bcl-2 mRNA 表达无 明显改变, Bcl-2/Bax 值降低。 5. Western Blot 检测显示经 2.5mg/ml 竹荪多糖处理 HCC-LM3 细胞 48h 后，促凋亡蛋白 Bax 及 Caspase-3 表达上调，抑凋亡蛋白 Bcl-2 表达无 明显改变，Bcl-2/Bax 值降低。 结论： 1. 竹荪多糖可抑制 HCC-LM3 细胞生长，并具有明显的时间、剂量效 应关系； 2. 竹荪多糖通过阻滞 HCC-LM3 细胞 G2/M 期调控细胞周期，延长孵育 时间，阻滞效果可获增强。 3. 竹荪多糖可以诱导 HCC-LM3 细胞凋亡，呈一定时-效关系； 4. 竹荪多糖可上调 Bax、Caspase-3 的表达，其蛋白表达和基因表达水平 变化一致。 5. 竹荪多糖可通过 Caspase 依赖的线粒体途径诱导 HCC-LM3 细胞凋亡， 其机制可能与 Bcl-2/Bax 降低，Bax、Caspase-3 上调相关。 关键词： 竹荪多糖；肝癌细胞；细胞增殖；细胞周期；细胞凋亡 前 言 肝癌为全球最常见的三大恶性肿瘤（胃癌、食管癌和肝癌）之一，90%的肝 癌为肝细胞癌（hepatocellular carcinoma ，HCC），其死亡率在癌症相关死亡中 排第三， 且新增肝 癌病例成 逐年增加 趋势 [ 1 , 2 ] 。 乙型肝炎 病 毒（hepatitis B virus ,HBV）、丙型肝炎病毒（hepatitis B virus ,HCV）感染，酒精过度饮用，非 酒精性肝肥大成为肝细胞癌发生的常见原因。随着科学技术的发展，HBV 疫苗 的应用，国内外 HBV 相关的肝细胞癌的发病率有所降低[3]。但我国肝癌发病率 是全球最高的国家，在常见肿瘤中肝癌发病率仅次于肺癌，位居第二位。 肝细胞癌没有特异性的临床症状，仅表现为上腹疼痛，有饱腹感，消瘦， 心神不安。患者出现肝硬化的表现入院 80%-90%被诊断为肝细胞癌，尽管肝移 植技术，手术切除技巧，围手术期管理及各种新型辅助治疗手段都有很大发展， [4] ，但肝细胞癌一经确诊大部分是晚期，不适合再进行手术切除。[5]即使能进行 手术的患者两年的复发率也为 50%。肝癌患者 5 年相对生存率为 12% ，中位生 存期仅为 6 个月到 20 个月。[6]肝癌治疗难度大主要原因在于肝癌的高复发性和 无有效的药物治疗，亟待新型靶向抗癌药物的研发。目前对肝癌治疗药物的研究 很多，不少也已应用于临床，但大部分药物疗效难尽人意，在肝癌药物研究中还 有很多未知领域，寻求低毒有效的药物成为目前研究的一个重要方向。天然药物 对化学合成药物的补充、替代和分子靶向治疗是目前国际医药研究的热点。具有 多种生物活性和化学结构的天然药物一直是治疗包括肿瘤在内的多种疾病的良 方，美国食品药品管理局近十年