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慢性心功能衰竭患者尿液代谢组学研究 　　摘 要 采用基于液相色谱-质谱联用的方法对慢性心力衰竭（Chronic heart failure， CHF）患者和正常对照（Control）人群的尿液进行分析， 筛选慢性心力衰竭患者尿液中的差异代谢物， 研究其发病机制， 并为临床治疗提供科学依据。选择15个慢性心力衰竭患者（年龄（62.27±3.14）岁）及15个正常人（年龄（65.41±4.63）岁）， 采用高分辨度快速液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱（RRLC-QTOF/MS）技术对尿液代谢物进行分析， 采用主成分分析（PCA）对两组代谢物进行分类， 并筛选潜在生物标记物； 运用偏最小二乘判别分析法（PLS-DA）建模， 考察生物标记物对疾病筛选的预测能力。研究结果表明， CHF组和Control组尿液代谢物谱能得到很好的区分， 发现并鉴定了2种潜在生物标记物尿苷及丙氨酰色氨酸， 提示嘧啶代谢和色氨酸代谢可能在心力衰竭发生发展中有重要作用。 　　关键词 心力衰竭； 快速高分辨液相色谱-?|谱； 尿苷； 丙氨酰色氨酸； 代谢组 　　1 引 言 　　心力衰竭（Heart failure， HF）是指由于心脏器质性或功能性疾病而导致心室充盈和射血能力的降低， 不能满足组织代谢需要， 从而引发的复杂临床综合征， 是冠心病、高血压、心肌梗死等多种心血管疾病的终末阶段。据美国心脏学会统计， 在过去30年， 心力衰竭的发生率及住院率增加了约3倍， 在65岁以上人群中排名首位[1]。心力衰竭的发生发展涉及代谢、神经激素、免疫系统等多个病理生理通路[2]。生物标志物一般是指可供客观测评病理生理状态下某种特征性的生化指标， 通过测定生物标志物可以获知机体所处的生物学状态和疾病的进程， 并为诊断、预后及治疗提供依据[3]。目前， 已发现许多心力衰竭相关的重要的生物标记物， 如脑钠肽（BNP）[4]、肿瘤因子TNF、白介素IL-1β、IL-6、IL-18、IL-33 及其受体sTNFR1 和sTNFR2等[5]， 但经验证并在临床上大范围使用的只有BNP， 虽然其它标记物浓度在心力衰竭患者中确实有一定程度的升高， 但因特异性和灵敏度均不理想， 尚未进入临床应用。目前， 寻找心力衰竭发生发展过程中新的生物标志物， 发现新的治疗靶点， 从而帮助心力衰竭患者风险分层及改善预后是心力衰竭的重要研究方向之一。 　　代谢组学是考察生物体系受刺激或扰动后（例如某个基因变异或某一病理生理状态下）其代谢产物-内源性代谢物质种类、数量及其变化规律的科学[6～10]。可以通过核磁共振、色谱-质谱联用技术等进行代谢物数据采集。核磁共振技术对样本分析选择性高且无损伤性， 而液相色谱-质谱技术拥有更高的灵敏度和分辨率。随着快速高分辨液相色谱（RRLC）的发展，其更高灵敏度、分辨率及分离度的特点使其更适合于代谢组学的研究[11]。 　　本研究采用高分辨快速液相色谱-四极杆-飞行时间串联质谱联用技术（Rapid resolution liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry， RRLC-QTOF/MS）对慢性心力衰竭（Chronic heart failure， CHF）患者的尿液进行代谢组学分析， 研究心力衰竭的特征性代谢谱， 从中筛选代表性生物标志物， 以期能为心力衰竭提供新的诊断策略， 并对分析心力衰竭的预后及治疗提供新的依据， 为进一步研究心力衰竭的发生机制提供参考。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂 　　Agilent1200快速分离液相色谱系统（美国Agilent公司）， 配备高压二元泵， 控温自动进样器； Agilent 6520 Q-TOF质谱仪（美国Agilent公司）， 配有ESI 离子源； Eppendorf 5804R 高速离心机（德国Eppendorf公司）； Milli-Q超纯水仪（美国Millipore公司）。 　　乙腈和甲酸（色谱纯， 美国TEDIA公司）； 其它试剂至少为分析纯； 实验用水为Milli-Q超纯水（18.2 MΩ?cm）。 　　2.2 样本来源 　　慢性心力衰竭患者尿样和正常人尿样均由吉林大学附属第一医院提供。研究对象选取我院心血管内科于2015年10～11月收治的CHF患者15例。入选标准： （1）均符合2014年中国心力衰竭诊断和治疗指南中心力衰竭诊断标准[12]。（2）按美国纽约心脏病协会（New York Heart Disease Association， NYHA）心脏功能分级Ⅲ到Ⅳ级， 其中Ⅲ级组6例、Ⅳ级组9例。排除标准： （1） 非心力衰竭主因入院者； （2）院内死亡者； （3）除冠心病、高心病、