拟南芥突变体kea表型分析及对生长素响应特征.docVIP

拟南芥突变体kea表型分析及对生长素响应特征 　　摘要：对拟南芥kea突变体表型分析的结果表明，在黑暗条件下，单个KEA缺失后下胚轴和主根伸长与野生型相比没有明显差异，而多个KEA缺失导致幼苗出现去黄化现象，表现为下胚轴伸长受到抑制，子叶完全打开，真叶开始出现，主根发育良好。qRT-PCT结果表明，呈现去黄化现象的kea多突变体内生长素合成基因[WTBX][STBX]IAA1、IAA3、IAA17[WTBZ][STBZ]的表达下调，而生长素转运基因[WTBX][STBX]AUX1、PIN1、PIN3、PIN7[WTBZ][STBZ]的表达没有明显变化。外源施加生长素类似物NAA能够恢复kea多突变体去黄化现象。上述结果暗示KEA在调控拟南芥光调控发育的某些方面发挥重要作用。 　　关键词：拟南芥；去黄化；生长素；暗形态建成 　　中图分类号： Q945.12文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）06-0030-03 　　植物在光照下和黑暗中表现为不同的生长特性；光照下萌发的幼苗表现为：下胚轴伸长受抑制、主根伸长、子叶展开、叶绿素累积，称为光形态建成（photomorphogenesis）。在黑暗中，植物的生长呈现出多种黄化特征，称为暗形态建成（skotomorphogenesis）[1]。黄化苗主要特点为迅速生长和伸长的下胚轴、发育迟缓的主根、闭合的子叶形成顶端弯钩（apical hook）[2]。在自然界中，种子发芽起始于暗形态建成过程：种子萌发后，大部分营养资源流向下胚轴，用于下胚轴伸长而不是子叶和根系的发育，这种快速伸长的方式为幼苗更早的接收光照提供了物理支持。此外，子叶通过紧闭形成顶端弯钩以保护地上部分生组织在幼苗破土而出时免遭伤害。这一生长策略能够保证幼苗在光合作用之前种子中贮备的有限营养物质更有效利用[3]。 　　暗形态建成过程受多种植物激素如生长素、脱落酸、细胞分裂素、油菜素内酯、赤霉素和乙烯的调控[2，4-7]。生长素能够促进多种植物器官的伸长，例如：下胚轴、胚芽鞘和根，其机理早在20世纪70年代由酸生长理论所解释[8-9]。此理论表明在数分钟内，通过细胞质膜H+-ATPase生长素促进质子外排，此过程降低了质外体间pH值，促进细胞壁松弛[10]。本研究筛选到几个kea突变体，其暗形态过程发生改变，通过分析下胚轴、主根的表观特征，并利用基因表达和药理学试验初步研究了其去黄化特征对生长素响应的改变，以期探讨KEA基因在拟南芥发育过程中的功能，为进一步阐述拟南芥光发育的相关机制提供良好的试验材料。 　　1材料与方法 　　1.1供试材料 　　1.1.1[JP2]植物材料拟南芥野生型Col-0，单突变体[WTBX][STBX]kea3、kea4、kea5、kea6[WTBZ][STBZ]；双突变体[WTBX][STBX]kea4/5[WTBZ][STBZ]和[WTBX][STBX]kea4/6[WTBZ][STBZ]，多突变体体[WTBX][STBX]kea4/5/6[WTBZ][STBZ]。其中[WTBX][STBX]kea3、kea4、kea5、kea6[WTBZ][STBZ]单突变体种子从ABRC拟南芥种子资源库购得。双突变体和多突变体通过杂交方法得来。[JP] 　　1.1.2生长条件和培养基光照培养箱（MMM，Germany）的培养条件为：温度23 ℃，相对湿度70%，连续黑暗培养。培养基修改自Pilot 等的配方[11]，成分包括：1 mmol/L CaSO4，2 mmol/L NH4NO3，1 mmol/L KH2PO4，1 mmol/L MgSO4，50 μmol/L NaFe-EDTA，50 μmol/L H3BO3，12 μmol/L MnCl2，1 μmol/L CuCl2，1 μmol/L ZnCl2，30 nmol/L （NH4）6Mo7O24，2.4 mmol/L MES（2-吗啉己磺酸），10 g/L蔗糖，8 g/L琼脂，用1 mmol/L KOH调至pH值5.7，121 ℃，100 kPa 灭菌20 min。 　　1.2试验方法 　　1.2.1拟南芥种子消毒和播种拟南芥种子，先用70%乙醇冲洗30 s，再用含有体积分数1%次氯酸钠和5 g/L SDS （十二烷基硫酸钠）的消毒液冲洗，并且剧烈振荡5 min，然后用无菌水冲洗5次，最后再加少量无菌水，4 ℃冰箱放置 48 h。播种于培养基，用医用胶带密封后竖直放置在生长箱培养。 　　1.2.2激素处理试验配制10 mmol/L 生长素类似物NAA，待培养基灭菌冷却至65 ℃左右，在超净工作台中，将NAA母液按照一定的稀释倍数添加到培养基。 　　1.2.3下胚轴和主根长测量拟南芥野生型和突变体在正常培