重组dsg3ec,1-2嵌合毒素对寻常型天疱疮外周血t b淋巴细胞的影响-effect of recombinant dsg 3 ec, 1 - 2 chimeric toxin on t b lymphocytes in peripheral blood of pemphigus vulgaris.docxVIP

第三军医大学硕士研究生论文 第三军医大学硕士研究生论文 PAGE PAGE 5 重组 Dsg3EC1-2 嵌合毒素对寻常型天疱疮 外周血 T B 淋巴细胞的影响 摘 要 目的 天疱疮是一类由自身抗体介导的慢性 器官特异性 自身免疫性大疱性皮 肤病 以患者体内出现针对表皮角质形成细胞表面天疱疮抗原的特异性 IgG 引起棘层 松解为特征 天疱疮发病中同时存在细胞免疫和体液免疫紊乱 天疱疮抗原刺激 B 细 胞产生自身抗体是导致天疱疮发病的主要因素 而 B 细胞产生自身抗体是 T 细胞依赖 性的 本实验选取含有能被寻常型天疱疮患者血浆中的 致病性抗体 特异性识别 含有 免疫优势表位 或称 致病性表位 的天疱疮抗原胞外结构域 Dsg3EC1-2 基因 片段 经原核表达获得重组嵌合毒素 Dsg3EC1-2PE40 并分离寻常型天疱疮患者的外 周血 PBMC 分别观察重组嵌合毒素对寻常型天疱疮患者外周血 T B 淋巴细胞的影 响 为进一步探讨寻常型天疱疮的靶向生物学治疗奠定基础 方法 在 BL21trxB(DE3)中对重组嵌合毒素 Dsg3EC1-2PE40 进行诱导表达 经免 疫蛋白印迹试验对重组嵌合毒素进行鉴定并用 IMAC 方法进行纯化 在此基础上 分 离寻常型天疱疮患者 PBMC 并进一步分离出 T 淋巴细胞 分别以不同浓度的重组嵌 合毒素作用于天疱疮患者的 T B 淋巴细胞 通过 ELISPOT 方法从单个细胞水平检测 抗体分泌 B 细胞的变化 并通过 MTT 比色试验及 3H-TdR 掺入试验来观察重组嵌合毒 素对 T 细胞的代谢及增殖的影响 结果 1. Dsg3EC1-2PE40 在 BL21trxB(DE3)中以可溶性形式表达 而 Dsg3EC1-2 在 AD494DE3中则以包涵体形式表达 从各时相的表达情况看到 Dsg3EC1-2 的表达 量随时间延长而增加 而 Dsg3EC1-2PE40 表达量随时间延长而增加的趋势不明显 2. Western Blotting 结果显示重组嵌合毒素蛋白能够特异性与 Pab IgG 结合 而与正常人 IgG 不能发生结合 3. 纯化后的重组嵌合毒素经浓缩后 终浓度达 547 g/ml 用 Quantity One 软件分析其纯度达 80%以上 4. ELISPOT 结果显示 与 Dsg3EC1-2 相比 重组嵌合毒素可使 PV 患者外周血 PBMC 中的抗体分泌 B 细胞数量减少约 40%左右 5. MTT 试验及 3H-TdR 掺入试验结果可见在 Dsg3EC1-2PE40 作用下 T 细胞的代谢 增殖较重组 Dsg3EC1-2 明显降低 二者间具有显著性差异 且当重组嵌合毒素的浓度 达到约 25 g/ml 时 其作用趋于稳定 结论 1. 对含有天疱疮抗原 Dsg3 抗原优势表位的 Dsg3EC1-2 片段及其重组嵌合 毒素 Dsg3EC1-2PE40 成功进行了原核表达 纯化和鉴定 所得重组嵌合毒素能够满足实 验的需要 为深入研究其生物学功能奠定了基础 2. 重组嵌合毒素能够特异性与 Pab IgG 结合 而与正常人 IgG 不发生结合 3. 重组嵌合毒素分子可以降低 PV 患者外周 血抗体产生 B 细胞的抗体产生作用 同重组 Dsg3EC1-2 相比 抗体产生 B 细胞数量减 少达 40%左右 4. 重组嵌合毒素对 PV 患者的外周血 T 细胞具有抑制或杀伤作用 与 Dsg3EC1-2 比较 Dsg3EC1-2PE40 可使其增殖代谢活性明显降低 关键词 天疱疮 桥粒芯糖蛋白 嵌合毒素 原核表达 固定金属鏊合亲和层析 自身抗体 T 细胞 B 细胞 PAGE PAGE 3 The Effect of Chimeric Molecules of Recombinant Dsg3EC1-2 with Toxin on T, B Lymphocytes in Pemphigus Vulgaris Abstract Objective: Pemphigus vulgaris is an autoantibodies-mediated, organ-specific chronic autoimmune blistering disease of the skin and mucous membranes. Autoantibodies IgG found in PV patients bind to the cell surface of keratinocytes and cause loss of cell to cell adhesion with resultant blister formation. The autoimmune target in