肿瘤干细胞样人胰腺癌细胞在癌侵袭 转移中作用的实验研究-experimental study on the role of tumor stem cell - like human pancreatic cancer cells in invasion and metastasis of cancer.docxVIP

华中科技大学博士学位论文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 PAGE 10 PAGE 10 肿瘤干细胞样人胰腺癌细胞在癌侵袭、转移中 作用的实验研究 华中科技大学同济医学院附属协和医院胰腺外科 博士研究生: 魏洪吉 导 师: 王春友 教授 中文摘要 第一部分 人胰腺癌细胞系成球能力及其 CD44、CD24 和 ESA 表达的研究 目的 研究不同人胰腺癌细胞系在特殊低粘附培养条件下的成球能力以及 该培养条件对其胰腺癌干细胞标志 CD44、CD24 和 ESA 表达的影响 方法 采用特殊的低粘附培养条件（SFM），观察四种不同人胰腺癌细胞系 (PANC-1, PC-2, MIA-Paca-2 和 BxPC-3)在该培养条件下形成肿瘤细胞球的能 力。应用流式细胞术检测胰腺癌干细胞标志 CD44、CD24 和 ESA 在不同细胞 系成球前后的变化，分析 SFM 培养对其 CD44、CD24 和 ESA 表达的影响 结果 四种人胰腺癌细胞系(PANC-1, PC-2, MIA-Paca-2 和 BxPC-3)中，只有 PANC-1 和 MIA-Paca-2 在 SFM 培养下形成了肿瘤细胞球；在 MIA-Paca-2 和 PC-2 细胞中，只检测到 CD44 的表达。在 PANC-1 细胞中，检测到 CD44 和 CD24 的表达，而在 BxPC-3 中，三种标志物 CD44、CD24 和 ESA 都有表达； 在 PANC-1 肿瘤细胞球中， CD44 阳性表达率下降 (85.21%±8.74% v. 98.88%±2.38%, Ρ0.01)，CD24 阳性表达率上升(13.32%±6.15% v. 1.22%±0.57%, Ρ0.01) ， CD24+CD44+ 上升 (12.60%±5.10% v. 1.43%±0.59%, Ρ0.01) ，在 MIA-Paca-2 肿瘤细胞球中，CD44 阳性表达率无明显变化(99.4±0.37% v. 99.43%±0.30%, P=0.919)。 结论 人胰腺癌细胞系 PANC-1 和 MIA-Paca-2 具有在 SFM 培养下形成肿瘤 细胞球的能力，胰腺癌干细胞标志 CD44、CD24 和 ESA 在不同细胞系中的表 达存在明显的不同，SFM 培养可以引起 CD44、CD24 和 ESA 表达的变化 【关键词】细胞表面抗原；肿瘤干细胞；胰腺癌；流式细胞术；细胞系 第二部分 人胰腺癌细胞系 PANC-1 肿瘤细胞球生物学特性 及其 SHH 表达的研究 目的 鉴定人胰腺癌细胞系 PANC-1 肿瘤细胞球在分化、致瘤性等方面的生 物学特性并检测其 SHH 的表达 方法 将 PANC-1 肿瘤细胞球改在有血清培养基（SCM）中进行培养，诱导 其分化，通过流式细胞术分析其胰腺癌干细胞标志 CD44、CD24 和 ESA 的表达 测定其分化能力。通过 BALB/c-scid 小鼠异种移植成瘤试验比较 PANC-1 肿瘤细 胞球与 PANC-1 细胞的成瘤能力，同时采用实时荧光定量 PCR 和 Western blot 分 别检测 SHHmRNA 及 SHH 蛋白在 PANC-1 肿瘤细胞球中的表达 结果 PANC-1 肿瘤细胞球经诱导分化后， CD44+ 上升 (94.80±4.77% v. 85.21±8.74%, Ρ0.01)，CD24+下降(1.57%±0.68% v. 13.32%±6.15%, Ρ0.01)， CD44+CD24+下降(1.55%±0.75% v. 12.60%±5.10%, Ρ0.01)，ESA-，与其来源 PANC-1 细胞相比，CD44、CD24 和 ESA 的表达情况相同；在 PANC-1 细胞组， 至少需要接种 5×104 个细胞才有肿瘤结节形成（1/3），而在 PANC-1 肿瘤细胞球 组，最少接种 1×104 个细胞即可观察到肿瘤形成（3/3）。组织切片 HE 染色显微 镜下观察，二者所形成移植瘤在组织结构方面无明显差异；与 PANC-1 细胞相 比，PANC-1 肿瘤细胞球细胞中 SHHmRNA 及 SHH 蛋白表达均明显升高，分 别为(4.23±0.85 v. 1.52±0.60, Ρ0.01) 和 (0.374±0.012 v. 0.274±0.023, Ρ0.05)。 结论 PANC-1 肿瘤细胞球具有肿瘤干细胞样生物学特性，其 SHH 表达无论 在 mRNA 还是在蛋白水平均有明显上调 【关键词】肿瘤干细胞；胰腺癌；生物学特性；流式细胞术；SHH 第三部分 肿瘤干细胞样人胰腺癌细胞在癌侵袭、转移中作 用的实验研究 目的 研究肿瘤干细胞样人胰腺癌细胞在胰腺癌侵袭、转移中的作用并探讨 其作用与上皮-间质转化（EMT）