左归丸对成体干细胞“组合分化”的调控作用及其生物安全性的实验分析-the regulatory effect of zuogui pill on.docxVIP

成都中医药大学博士学位论文 成都中医药大学博士学位论文 PAGE PAGE 1 左归丸对成体干细胞“组合分化”的调控作用及其生物安 全性的实验研究 博士研究生 黄 勇 导 师 邓友章 教授 摘 要 目的：该项目研究的目的是在中医“肾藏精”“肾主骨”理论与近代干细胞分化 理论相结合的学术思想指导下，研究左归丸配伍规律对骨髓源成体干细胞（ASC）分化 的影响，通过对左归丸的拆方分析研究，从中寻找出干细胞的“组合分化”诱导剂，并 研究其生物学特性和生物学安全性，为中医药在再生医学中的应用提供实验依据。 方法：采用骨髓源 ASC 培养，经左归丸撤药分析处理，作细胞化学、免疫组织化 学、染色体分析、双层琼脂扩散实验、裸鼠体内成软骨实验和致瘤实验等观察，对分化 的后代干/祖细胞的生物学特性和生物安全性进行检测和鉴定等体内外相结合、多指标 同步观察的方法，对结果进行综合分析后作出客观的评价。 结果：研究结果表明，各药物组均能诱导骨髓源 ASC 向成骨样细胞、软骨样细胞、 神经元样细胞、神经胶质样细胞和血管内皮样细胞等方向分化。其中左归丸Ⅰ号（全方） 主要诱导 ASC 向神经元样细胞方向分化，而左归丸Ⅱ号（从全方中减去龟、鹿二胶）则 主要诱导 ASC 向成骨样细胞和成软骨样细胞方向分化。从左归丸Ⅱ号方中撤出枸杞、山 茱萸后神经元烯醇化酶（NSE）表达降低，但撤出熟地后 NSE 表达却明显升高，提示龟 胶、鹿胶、枸杞、山茱萸可诱导 ASC 向神经元样细胞方向分化，但熟地可能具有抑制（或 调控）ASC 向神经元样细胞方向分化的作用。从Ⅱ号方中撤出牛膝后Ⅱ型胶原表达明显 降低，表明牛膝可诱导 ASC 向软骨样细胞方向分化；撤出山药碱性磷酸酶（ALP）活性 明显降低，表明山药可诱导 ASC 向成骨样细胞方向分化；撤出枸杞、熟地第Ⅷ因子表达 降低，但撤出山茱萸后第Ⅷ因子表达却明显升高，提示枸杞、熟地可诱导 ASC 向内皮样 细胞方向分化，但山茱萸可能具有抑制（或调控）ASC 向内皮样细胞方向分化的作用。 从“左归丸”拆方分析中经优化组合而成的中药“组合分化”诱导剂，可以诱导 ASC 定 向分化为软骨干/祖细胞，在裸鼠体内可形成软骨并有较好的生物安全性。 结论：（1）首次提出成体干细胞“组合分化”假说，研究思路新颖，具有一定的 创新性。成体干细胞“组合分化”既不同于无科学实验依据的“横向分化”，又不同于 当前国内外用细胞因子或药物单体诱导的单一干细胞的定向分化。它是根据复方中药具 有多活性成分、多作用途径、多环节和多靶点的调节作用特点，结合现代成体干细胞新 概念认为任何组织内均存在各种类型干细胞的观点，在体外培养条件下，用药物（单味 或复方）诱导而被激活的细胞分化，决非单一干细胞的定向分化，而是各种类型干细胞 均有不同程度的增殖与分化，应属于“组合分化”。采用不同配伍还可改变干细胞的 “组合分化”细胞群。这种诱导分化的最显著特点是“组合分化”的后代干/祖细胞可 相互构成生存的微环境，有利于各类干细胞生长在一个适宜的微环境中，始终保持正常 时的不对称性有丝分裂过程，这种干细胞/祖细胞才是健康的和生物安全性高的细胞。 因此，采用“组合分化”一词更能充分体现出中医药 ASC 分化诱导剂的特色和优势，这 也是本项目研究的创新点。（2）成体干细胞“组合分化”的研究丰富了“肾藏精”，“肾 主骨”理论的科学内涵。中医肾所藏之精除了先天生殖之精和后天水谷精微之外，还应 包括干细胞的生物学特性。因此，国内有学者认为“干细胞是先天之精和后天之精在细 胞层次的体现”。我们研究的中医药补肾法诱导成体干细胞的“组合分化”可认为是 “肾藏精”、“肾主骨”在再生医学中的一种表达方式。通过成体干细胞“组合分化” 研究能更深刻地理解“肾藏精”对全身五藏六腑的调节功能。（3）为补肾方的研究提供 了新的思路和方法，突出了中医药特色。实验结果表明，以“组合分化”各种类型干细 胞为生物学效应指标，用以研究补肾中药复方配伍规律是可行的，是大有作为的。中药 复方中的多活性成分、多作用途径、多环节、多靶点的调节作用特点，不仅可以诱导 ASC“组合分化”，而且还可以用不同的配伍来调控“组合分化”中各种类型干细胞的 分化程度和所占的比例，以适应不同疾病修复的需要，这是任何单体或细胞因子的诱导 剂难以做到的。这充分体现出中药复方的特色和优势，应用前景极为广阔。（4）从左归 丸拆方分析中优选出的软骨干细胞“组合分化”诱导剂，在高密度细胞培养条件下，可 诱导 ASC 分化为软骨样细胞，移植于裸鼠体内可形成软骨组织，但未发现细胞恶变。说 明骨髓源 ASC 经该“组合分化”诱导剂分化处理后，其子代的干/祖细胞是具有软骨细 胞的生物学特性和生物学功能，并具有可靠的生物安全性，可以作为中医药组织工程的 种子细胞