斑点叉尾t病毒ORF6基因高效可溶表达及抗原性分析.docVIP

斑点叉尾t病毒ORF6基因高效可溶表达及抗原性分析 　　摘要：利用ＧＳＴ融合基因表达系统表达ＧＳＴ－ＧＰ６融合蛋白，以质粒ｐＭＤ１９－Ｔ－ＯＲＦ６为模板，扩增出ＯＲＦ６基因片段，将其克隆至大肠杆菌表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２，将所构建的重组质粒ｐＧＥＸ－４Ｔ－２－ＯＲＦ６转化Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＲ２５６６，并诱导表达，采用ＧＳＴ蛋白纯化系统进行纯化，所得产物进行１０％ＳＤＳ－ＰＡＧＥ及Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果表明，大肠杆菌细胞经诱导高效表达出约４２ｋＤ蛋白，其分子量与ＧＳＴ－ＧＰ６融合蛋白相符，表达产物以可溶的形式存在。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ分析表明，融合蛋白能够与斑点叉尾?t病毒（Channel catfish virus，ＣＣＶ）阳性血清发生特异性反应，表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性。 　　关键词：斑点叉尾?t病毒；ＯＲＦ６基因；高效可溶表达；抗原性 　　中图分类号：Ｓ９４１．４１文献标识码：Ａ文章编号：0439－８114（２０11）05－1001-03 　　 　　Ｈｉｇｈ Ｓｏｌｕｂｌｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎｄ Ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ ｏｆ ＯＲＦ６ Ｇｅｎｅ ｏｆ Ｃｈａｎｎｅｌ Ｃａｔｆｉｓｈ Ｖｉｒｕｓ 　　 　　ＬＩＵ Ｙｕ－ｌｉｎ１，２，ＷＡＮＧ Ｗｅｉ－ｍｉｎ２，ＷＡＮＧ Ｍｉｎ２，ＬＩ Lｉ－ｊｕａｎ２ 　　（１．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｉｓｈｅｒｙ， Ｈｕａｚｈｏｎｇ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｗｕｈａｎ ４３００７０，Ｃｈｉｎａ； 　　２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｙａｎｇｔｚｅ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｇｚｈｏｕ ４３４０２５，Hubei，Ｃｈｉｎａ） 　　 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ： Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＧＳＴ－ＧＰ６ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｕｓｉｎｇ ＧＳＴ ｇｅｎｅ ｆｕｓｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ gene ORF6 ｗａｓ ａｍｐｌｉｆｉｅｄ ｆｒｏｍ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＭＤ１９－Ｔ－ＯＲＦ６ ａｎｄ ｃｌｏｎｅｄ ｉｎｔｏ ｐＧＥＸ－４Ｔ－２ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｖｅｃｔｏｒ． Ｔｈｅ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｐｌａｓｍｉｄ ｐＧＥＸ－４Ｔ－２-ＯＲＦ６ ｗａｓ ｅｘｐｒｅｓｓｅｄ ｉｎ Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＲ２５６６ ｃｅｌｌｓ ａｎｄ ｔｈｅ ｐｒｏｄｕｃｔｓ ｗｅｒｅ ｐｕｒｉｆｉｅｄ ｂｙ ＧＳＴ ｐｕｒｉｆｙｉｎｇ ｓｙｓｔｅｍ． Ｔｈｅ ｒｅｓｏｌｖｅｄ ＧＳＴ－ＧＰ６ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｏｎ １０％ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｓｈｏｗｅｄ ａ ｍａｊｏｒ ｂａｎｄ ａｔ ｐｏｓｉｔｉｏｎ ｏｆ ４２ｋＤ ａｎｄ ｔｈｅ ｆｕｓｉｏｎ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗａｓ ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ ｂｙ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｏｆ channel catfish virus（ＣＣＶ）． 　　Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ： channel catfish virus； gｅｎｅ ＯＲＦ６； ｈｉｇｈ ｓｏｌｕｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ； ａｎｔｉｇｅｎｉｃｉｔｙ 　　 　　斑点叉尾?t（Ｉｃｔａｌｕｒｕｓ ｐｕｎｃｔａｔｕｓ）具有生长速度较快、肉质细嫩、销售价格较高的特点，我国于１９８４年从美国引进后，其养殖规模逐步扩大。但是，近年来斑点叉尾?t病毒性疾病（Ｃｈａｎｎｅｌ ｃａｔｆｉｓｈ ｖｉｒｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ，ＣＣＶＤ）的流行，对养殖生产的威胁日益增加。该病为斑点叉尾?t特有，亲鱼是传播该病给鱼苗的主要传染源［１－２］，有较高的致死率，在一些养殖场甚至高达１００％。在美国，该病造成的损失占疾病造成斑点叉尾?t养殖损失的２％［３］。斑点叉尾?t病毒（Channel catfish virus，ＣＣＶ）的主要结构蛋白ＧＰ６是由ＯＲＦ６基因编码的糖基化囊膜蛋白，具有较好的免疫原性，能够诱导产生中和抗体［４－８］，在ＣＣＶ的诊断、预防与控制等方面具有重要意义。 　　ＧＳＴ基因融合表达系统被广泛用于各种融合蛋白的表达，它包含一系列的表达载体，可以在大肠杆菌和酵母等宿主细胞中表达ＧＳＴ融合蛋白，与其他系统相比具有表达效率高、纯化蛋白效果好，操作简便等特点，表达的蛋白质可用于制备抗体和在体外研究蛋白质的相互作用［９］。本研究采用ＧＳＴ基因融合表达系统和原核高效表达载体ｐＧＥＸ－４Ｔ－２在Ｅ． ｃｏｌｉ ＥＲ２５６６细胞中高效可溶表达ＣＣＶ的ＧＰ６蛋白，并对重组蛋白进行了纯化，突破了一般大肠杆菌表达载体以包涵体形式表达外源蛋白的瓶颈，为进一步研究ＧＰ６蛋白的结构与功能奠定了基础。 　　１材料与方法 　　１．１菌株与载体 　　质粒ｐＭＤ－１９－ＯＲＦ６为本实验室前期构建。