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有机氯农药与肿瘤相关基因DNA间作用机制研究 　　摘要：利用紫外可见（UVvis）吸收光谱、荧光（FL）光谱和圆二色谱（CD）研究了3种有机氯农药＼[DDT， DDE和DDD＼]与人类肿瘤相关基因（p53 DNA和Cmyc DNA）的相互作用，阐明有机氯农药的基因毒性。UVvis和FL光谱实验表明， 有机氯农药主要通过嵌插方式与DNA碱基作用，形成非共价复合物。通过FL实验得到的农药分子与p53 DNA的结合能力顺序为：DDEDDTDDD，对Cmyc DNA为：DDDDDEDDT；并通过计算结合过程的热力学常数证实以疏水作用为主要的作用力。CD实验表明， 部分有机氯农药能够影响DNA的碱基对堆积和二级结构，很可能进一步造成DNA损伤，并最终导致基因突变。 　　关键词：有机氯农药； 脱氧核糖核酸； 相互作用； 光谱法； 嵌插作用 　　1引言 　　有机氯农药主要以苯或环戊二烯两大类为原料，曾作为杀虫剂被广泛使用于农业生产中，其化学性质稳定和难以分解的特性造成了环境的严重污染。接触有机氯农药后，罹患白血病、乳腺癌、中枢神经系统（CNS）肿瘤以及Wilm′s肿瘤的风险增大[1，2]。已有研究表明， 有机氯农药能对人体血红细胞和淋巴细胞中DNA造成损伤，具有诱导基因癌变的可能性[3，4]。80%肿瘤疾病受到环境因素的影响[5，6]。因此有必要在分子水平上探讨环境中有机小分子与人类肿瘤相关DNA间的作用机制。小分子物质与DNA之间的非共价结合方式主要有嵌插结合、沟区结合和静电结合，其中当小分子嵌插到DNA碱基对之间后，可以直接抑制DNA的复制与转录，甚至使DNA链断裂受损。此外，有机小分子可能会与DNA形成加合物而引起DNA的损伤，有可能产生诱变作用而最终引发癌变[7，8]。 p53基因是一种抑癌基因，人类癌症中约有一半是由于该基因发生突变失活，是迄今发现与人类肿瘤相关性最高的基因[9～12]。Cmyc基因是一种可使细胞获永生化功能，促进细胞分裂的基因[13，14]。研究发现， 多种肿瘤疾病中都发现有Cmyc基因的扩增或过度表达[15，16]。 　　本研究选择3种有机氯农药DDT及其在环境中脱氧化氢产物DDE和还原产物DDD（图1）为研究对象，利用一些谱学方法系统研究这些农药与人体肿瘤相关基因（p53抑癌基因和Cmyc癌基因）启动子???双螺旋DNA间的相互作用，希望能为农药生物毒性的解析、肿瘤疾病的预防和治疗提供线索。 　　3结果与讨论 　　3.1紫外滴定实验研究有机氯农药分子与DNA的作用模式 　　研究证明，有机小分子与DNA的相互作用会引起小分子的特征吸收带出现红移（蓝移）现象或增色（减色）效应。尤其是以嵌插方式与DNA碱基对发生作用时，小分子的光谱变化会更明显。随着DNA的加入，有机氯农药分子溶液的UVvis吸收光谱变化明显。由图2A可知，在加入p53 DNA之后，有机氯农药DDE在213和288 nm处的特征吸收峰分别发生了15和11 nm的红移，同时减色程度分别为63.8%和30.2%，并且在337 nm处出现等吸收点。而在加入Cmyc DNA之后，DDD的光谱信号变化最为显著，其位于209和243 nm处的特征吸收峰分别减色55.8%和42.9%，209 nm处特征紫外吸收峰出现了8 nm的红移，在298 nm处出现了等吸收点，而243 nm处特征吸收峰的位移不明显。吸光度的显著减弱以及吸收带发生红移都证实了有机氯农药分子嵌插入DNA的碱基对之间与DNA结合[17]，等吸收点的出现说明有机氯农药分子和DNA之间形成非共价复合物[18]。 　　3.3荧光竞争实验比较有机氯农药分子与DNA作用的亲合能力 　　溴化乙锭（EB）是一种具有共轭芳香环的平面分子，在TrisHCl缓冲溶液中，单独的EB荧光非常弱，但它能平行地嵌入双螺旋DNA的碱基对中，使荧光显著增强。本实验利用EB作为目标DNA的荧光探针，通过荧光竞争实验研究有机氯农药分子与DNA嵌插作用的亲合力。结果表明，随着有机氯农药浓度不断增加，DNAEB体系的荧光强度逐渐减弱，表明有机氯农药分子会和EB竞争与DNA结合于DNA的作用位点（图3），使得嵌插在DNA碱基对中的EB不断被置换出来。 　　小分子与DNA的相互作用有可能受多种作用的共同影响，通过在荧光光谱实验中改变溶液的离子强度来判断有机氯农药分子与DNA分子之间是否有静电作用。溶液中离子强度的增加能够抑制有机氯农药分子与DNA分子之间通过静电作用相互结合，表现为荧光猝灭减弱。本实验利用强电解质NaCl控制有机氯农药和DNA体系的离子强度，实验见表3。由表3可知，在加入NaCl溶液后，有机氯农药与DNA溶液体系的荧光强度未增大反而减小，表明有机氯农药和DNA之间没有静电作用。双链DNA之间由于磷酸