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梨Ty1copia类逆转座子逆转录酶序列克隆及分析 　　摘要：根据Ty1—copia类逆转座子逆转录酶的保守区设计简并引物，从10份梨属（Pyrus）材料中扩增该逆转座子片段。扩增产物经纯化后克隆于pMD18—T质粒载体，选择阳性克隆，再经菌落PCR鉴定、测序及序列分析，获得了14条梨Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列。这些核苷酸序列长度为250～267 bp，具有较高的异质性，主要表现为缺失突变，通过核苷酸聚类可将14条序列分为4个家族。对这些片段的氨基酸序列进行分析，结果显示有2个序列发生了终止密码子突变。该研究获得的梨属植物Ty1—copia类逆转座子逆转录酶氨基酸序列与已报道的其他生物的相应序列有较高的一致性。 　　关键词：Ty1—copia类逆转座子逆转录酶；梨（Pyrus）；克隆；序列分析 　　中图分类号：S661.2 文献标识码：A 文章编号：0439—8114（2012）19—4388—03 　　逆转座子（Retrotransposon）是真核生物中种类最多、分布最广的转座因子，也是高等植物核基因组的重要组成部分[1]。各种生物和非生物因子的胁迫都可能诱导逆转座子发生转座，导致基因突变、基因组扩增及重排等，造成植物的遗传变异，从而成为自然选择的源泉[2—5]，其序列的克隆与分析研究对于植物基因组组成、进化与基因的表达调控研究均有重要的意义。迄今已在苹果[6，7]、柑橘[8]、柿[9]、葡萄[10]等主要果树作物中研究分析了逆转座子的种类和组成。其中Ty1—copia类逆转座子在植物界广泛分布，是研究最多的一类[3—5]。目前关于梨逆转座子的报道较少，该研究依据Ty1—copia类逆转座子逆转录酶的保守序列设计简并引物，采用PCR方法进行梨属植物Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列的分离克隆，并通过序列分析初步研究其变化特点，以期为梨属植物的逆转座子研究奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 材料 　　本研究材料包括2个西洋梨（Pyrus communis L.）品种早红考密斯和康福伦斯，2个砂梨（P. pyrifolia Nakai.）品种丰水和蒲瓜梨，2个白梨（P. bretschneideri Rehd）品种雪花梨和鸭梨，2个秋子梨（P. ussuriensis Maxim）品种安梨和花盖梨，以及两个砧木种杜梨（P. betulaefolia Bge.）和豆梨（P. calleryana Dcne.），共10份材料。 　　1.2 方法 　　1.2.1 梨基因组DNA的提取及Ty1—copia类逆转座子逆转录酶的扩增 取刚展开的嫩叶，采用CTAB法[11]提取基因组DNA，并用紫外分光光度计测定DNA浓度。参照文献[12]设计Ty1—copia类逆转座子逆转录酶的引物，上下游引物序列分别为：5′—ACNGCNTTPyPyTNCAPyGG—3′，5′—APuCATPuTC 　　PuTCNACPuTA—3′，其中N=A+T+C+G，Py=A+G，Pu=T+C。PCR反应体系为：DNA 20 ng，dNTPs 0.2 mmol/L，引物0.3 μmol/L，2.0 μL 10×Buffer，2.5 mmol/L Mg2+，1 U Taq DNA聚合酶（上海Sunny公司生产），加双蒸水至20 μL。PCR扩增程序为：94 ℃ 120 s；94 ℃ 30 s，53 ℃ 60 s，72 ℃ 90 s，35个循环；72 ℃ 5 min。反应在Bio—Rad S1000型PCR仪上完成。 　　1.2.2 PCR产物的回收、克隆及转化 用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用TaKaRa凝胶回收试剂盒回收早红考密斯的PCR扩增产物。回收产物经纯化后连接于pMD18—T载体上，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，37 ℃培养16～20 h后蓝白斑筛选，挑取白色单克隆，在含有100 mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基中培养过夜后PCR鉴定阳性克隆。 　　1.2.3 Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列测定及序列分析 将鉴定为阳性的菌液送往北京六合华大基因科技股份有限公司测序。利用DNAStar和DNAMAN软件对获得的逆转录酶序列进行分析。 　　2 结果与分析 　　2.1 Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列的PCR扩增结果 　　采用1%琼脂糖凝胶电泳对Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列的PCR扩增产物进行检测，结果如图1，供试的10份梨属植物材料均能扩增出长度约为260 bp的Ty1—copia类逆转座子逆转录酶片段，与之前的报道一致，说明Ty1—copia类逆转座子在梨属植物中普遍存在。 　　2.2 Ty1—copia类逆转座子逆转录酶序列测定结果 　　将以早红考密斯基因组DNA为模板扩增得到的