柑橘CitSERK基因正义与反义表达载体构建及其体系优化.docVIP

柑橘CitSERK基因正义与反义表达载体构建及其体系优化 　　摘要 以Kpn I和Xho I双酶切带有CitSERK基因cDNA全序列的T/A克隆载体，同时以Kpn I和XhoI双酶切PMV载体，凝胶回收目的基因片段及PMV载体骨架片段，成功构建了CitSERK基因正义与反义表达载体，并对遗传转化载体构建体系进行了优化。结果表明：以Kpn I和Xho I双酶切带有CitSERK基因的T/A克隆载体和PMV载体，成功得到带有Kpn I和Xho I双酶切位点的目的基因片段和PMV载体骨架片段；酶切检测结果显示，阳性克隆成功酶切出预期大小的CitSERK基因片段和PMV载体骨架片段；2对特异引物PCR检测结果显示，阳性克隆同时扩增出预期大小的CitSERK基因片段。 　　关键词 柑橘；CitSERK；载体构建；体系优化 　　中图分类号 Q943.2 文献标识码A文章编号1007-5739（2008）14-0013-02 　　 　　通过转基因手段超量或者反义抑制目标基因的表达，是植物功能基因组学常用的手段。通过这2种手段，人们已经鉴定了许多植物基因的功能，并已成为功能基因组学的一种强有力的研究工具应用于遗传学研究。植物遗传转化载体的成功构建是通过转基因手段进行超量或者反义抑制目标基因表达的先决条件。正义（超量）和反义抑制表达载体的构建是通过酶切、连接的方法将目的基因以正向和反向的方式替换掉植物遗传转化研究载体pBI121中的GUS基因片段，让目标基因在35S启动子的驱动下以正向和反向的形式进行基因表达。为了分析柑橘CitSERK基因潜在的生物学功能，初步比较反义抑制和超量表达对目标基因表达的影响，本研究成功构建了CitSERK基因的正义（超量）表达和反义抑制植物遗传转化载体，目的基因片段大小为1 866bp，其重组质粒分别命名为pBSCitSERK和pBACitSERK。 　　 　　1材料与方法 　　 　　1.1植物材料 　　供试的愈伤组织来自华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室，品种为暗柳橙，英文名为Anliucheng sweet orange，学名为Citrus sinensis。 　　1.2菌株、质粒及试剂 　　大肠杆菌菌株DH5α、农杆菌菌株LBA4404 均为本实验室保存。表达载体质粒pMV（基于pBI121改造，张俊红）。pMD18-T购自TaKaRa公司。Taq DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制性内切酶购自Fermentas公司；保真DNA聚合酶Probest购自TAKARA公司???其他相关试剂购自上海生工生物工程等公司。 　　1.3PCR扩增带XhoI和KpnI 酶切位点的CitSERK基因全长cDNA 　　根据RT-PCR获得的CitSERK基因的全长序列，DNA测序和序列酶切位点分析后，设计并合成以下2对引物： 　　SFGF：CCGCTCGAGATGAAGACTAAGGTTTG GGCT 　　SFGR：GGGGTACCTCACCTTGGACCAGATAA 　　CTCA 　　AFGF：CCGCTCGAGTCACCTTGGACCAGATAA CTCA 　　AFGR：GGGGTACCATGAAGACTAAGGTTTG GGCT 　　以通过RT-PCR获得CitSERK基因cDNA为模板，利用SFGF/SFGR和AFGF/AFGR 2对引物，通过PCR扩增获得在CitSERK基因5’端加XhoI、3’加KpnI酶切位点和在5’端加KpnI、3’加XhoI酶切位点的2条CitSERK基因cDNA全序列。 　　1.4Sense和Antisense植物表达载体构建 　　以Kpn I和Xho I双酶切带有目的基因全长片段的T/A克隆载体，同时以Kpn I和XhoI双酶切PMV载体（基于pBI121改造，张俊红），0.8%琼脂糖胶分析，凝胶回收目的基因片段及PMV的载体骨架，克隆片段与载体骨架以3∶1的比例混合，加入T4 DNA连接酶1μL，反应缓冲液1μL，无菌水补充体积至10μL。4℃连接16h，取10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α，Km（卡那霉素）抗性平板筛选阳性克隆，通过基因特异引物PCR检测和酶切分析验证克隆。 　　提取阳性重组子质粒，利用电转化仪在1 800V的电压下转化农杆菌LBA4404，用含Km 50mg/L的LB固体平板筛选，28℃培养2～3d后挑选阳性克隆进行鉴定。 　　 　　2结果与分析 　　 　　2.1CitSERK基因全长cDNA和PMV载体骨架的获得 　　利用XhoI和KpnI双酶切T/A克隆质粒和目标载体PMV，阳性克隆可以切出带有XhoI和KpnI双酶切位点预期大小的CitSERK基因和PMV载体骨架片段（图1）。与左侧的Mar