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柑橘种间体细胞杂种核质遗传研究 　　摘要：为了解柑橘体细胞杂种的核质遗传组成，采用流式细胞仪(FCM)、简单序列重复(SSR)、相关序列扩增多态性(sRAP)以及酶切扩增多态性序列(CAPS)对此前通过对称融合获得的2株种间体细胞杂种进行了分析。结果表明，在丹西红橘+红江橙种间组合中，分析的2株植株中1株为二倍体非对称体细胞杂种，其核DNA具有双亲的部分DNA，并有重组发生，胞质DNA则来源于红江橙(叶肉亲本)；而另1株则是异源四倍体体细胞杂种，其核DNA来源于双亲，并有重组发生，胞质DNA则来源于红江橙。 　　关键词：柑橘；体细胞杂种；FCM；SSR；SRAP；CAPS 　　中图分类号：S666 　　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2010)02-183-05 　　 　　自获得首例柑橘体细胞杂种以来，柑橘原生质体融合取得了较大的进展，研究涉及的类型不断增多，研究的范围也不断扩大，研究的手段也得到了提高。20D0年以前，获得的绝大多数柑橘体细胞杂种，由于研究手段限制或花费较高仅根据同工酶或RAPD分析确定其杂种性，而没有分析其核和胞质DNA来源。随着分子标记的增多(如AFLP、SSR和CAPS等)，柑橘体细胞杂种核质遗传研究也趋于简捷。 　　我们于1999年采用原生质体融合获得了丹西红橘+红江橙种间组合体细胞杂种，其杂种性已被RAPD分析所确认。该组合目前有2株体细胞杂种，生长势较旺，其中1株的叶片与红江橙相似，长椭圆形，有翼叶，属于叶肉亲本再生类型；而另外1株为多倍体形态特征，叶片大、肥厚、叶色深。我们采用FCM、SSR、SRAP以及CAPS对这2株种间体细胞杂种进行了核质遗传分析。该研究有利于从遗传本质上认识柑橘体细胞杂种杂交过程中的遗传规律，可以研究柑橘体细胞杂种核质互作，了解柑橘核质组成对体细胞杂种田间表现的影响，为选配融合亲本提供理论指导，为柑橘体细胞杂种应用于育种实践奠定基础。 　　 　　1　材料和方法 　　 　　1．1　材料 　　本试验中丹西红橘(Citrus reticulata)+红江橙(C. sinensis Osbeck cv．Hongjiangcheng)融合组合获得的2株植株于2001年移入田间。 　　 　　1．2　倍性分析 　　供试材料的倍性鉴定用德国PaYee GmbH公司生产的流式细胞仪完成。参照Xu等的方法并做适当修改。取0.5cm2的幼嫩叶片置于小培养皿中，加入0.5mL的Panec HR-A溶液用刀片切碎，处理3min后，将样品通过30μm的Partec CelltricsTM微孔膜过滤到测试管中，加入Partec HR-B2mL，然后用Panec倍性分析仪测定样品单个细胞核的DNA总量。样品DNA含量的分布曲线由倍性分析仪自动生成。 　　 　　1．3　总DNA的提取、SSR分析、CAPS分析 　　总DNA的提取参照Liu等的方法。取4～5g幼嫩叶片加入适量液氮研碎后，加入CTAB DNA提取缓冲液，65℃水浴。纯化后，最后溶于TE成分中，-20℃保存备用。 　　SSR分析参照Liu等的方法，并稍加改动。本研究中共选用了4对核基因组SSR引物，即TAA1、TAA15、TAA45、TAA41，引物由上海生物工程公司合成。PCR扩增反应在Peltier-200热循环仪上进行，反应体系为20μL，其中含50ng模板、1.0U TaqDNA聚合酶、1×缓冲液、1.5mmol?L-1MgCl2、0.2mmol?L-1dNTPs和正反向引物各0.1μmol?L-1。扩增程序为：94℃变性1min，55℃退火40s，72℃延伸2min，扩增32个循环后72℃复性10min。扩增产物加热煮沸变性后，在6％变性聚丙烯酰胺凝胶(含0.5倍TBE)上分离，在恒定功率60W下电泳约2h或二甲苯氰(Xylene Cyanol FF)指示剂距离凝胶底部约1/2处。电泳结束后，用银染法得到被扩增的DNA谱带，银染过程参照银染测序试剂盒Q4130技术手册(Promega，美国)。 　　CAPS分析参照Demesure等文献，使用5个叶绿体和3个线粒体通用引物在PTC-200热循环仪中对总DNA进行PCR扩增。反应体系为(50μL)：100ng模板、2.0mmol?L-1MgCl2、0.2mmol?L-1dNTPs、2.5U Taq DNA聚合酶、1×缓冲液和正反向引物各0.1mmol?L-1。扩增程序与SSR分析的相同。取6μL PCR扩增产物在用5U限制性内切酶(本实验共使用了11种，包括HaelII.Hinfl,Hindlll.MspI,TasI,TaqI,RasI,AluI,DraI,MboI,MseI等)保温3～4h，在2.0％的琼脂糖凝胶(含5μg?mg-