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柑橘内参基因稳定性评价 　　摘要： 【目的】为了筛选在柑橘中稳定表达的内参基因，以确保柑橘基因表达分析结果的可靠性。【方法】选取Actin、18SrRNA、rpII、GAPDH、UBQ10、UBQ1作为候选内参基因，以geNorm、Normfinder、BestKeeper 以及RefFinder软件分析这6个基因在冰糖橙的根、茎、叶、果实以及干旱、低温、溃疡病、衰退病胁迫下叶片中的表达稳定性。【结果】结果表明，在不同柑橘器官及不同胁迫处理下的柑橘叶片中，候选内参基因的表达稳定性确实存在差异。在不同柑橘器官之间比较用UBQ10和rpII；干旱胁迫下用GAPDH、18SrRNA和 Actin；低温胁迫下用UBQ10、Actin和18SrRNA；溃疡病菌侵染胁迫下用Actin、UBQ10和GAPDH；感染衰退病毒时用18SrRNA和rpII。【结论】为了获得较为稳定的表达分析结果，建议根据不同的试验内容选择不同的内参基因组合。 　　关键词： 柑橘； 内参基因； 稳定性评价； RT-qPCR； 基因表达分析 　　中图分类号：S666 文献标志码：A 文章编号：1009-9980？穴2012？雪06-978-07 　　RT-qPCR因其灵敏度高、特异性强、可用于低丰度mRNA的表达分析而成为广泛应用的基因表达分析技术[1]。为了确保试验结果的准确性和可靠性，RT-qPCR需要选用合适的内参基因来消除不同样品在RNA产量、质量以及反转录效率上可能存在的差别，从而实现对不同样品中RNA的定量和数据归一化。作为基因表达分析时用于衡量目的基因表达量的参照标准，内参基因常为表达相对稳定的持家基因。但最近的研究表明，在不同的组织、器官，不同的发育阶段以及不同处理条件下，这些持家基因的表达也会发生变化，盲目地选用持家基因作为内参基因，就会导致基因表达分析结果准确性降低甚至得到相反或错误的结论[2]。因此选择合适、稳定的内参基因非常关键。geNorm[3]、NormFinder[4]、BestKeeper[5]等程序以及Delta CT法[6]已广泛应用于内参基因的筛选与评价。Xie等[7]将这上述4种分析方法整合成一个网上综合分析工具——RefFinder，用于各种试验条件下内参基因的筛选与评价，能够得到与单独使用各分析方法一致的结果，并能综合评价上述4种分析方法的结果，避免了单个分析方法分析的片面性。目前，国内外研究者已应用上述分析方法在多种植物中进行了内参基因的筛选。前人对柑橘内参基因也进行了一些初步筛选，在干旱胁迫下的Swingle 枳柚（Poncirus trifoliata×Citrus paradisi）中[8]、在感染柑橘脚腐病菌（Phytophthora parasitica）后的枳（P. trifoliata）、酸橘（C. sunki）以及2者的杂种中[9]分别筛选过一些内参基因，但都是局限于少数试验条件下的分析。Mafra等[10]分析了候选内参基因在柑橘不同器官及不同生物胁迫下的稳定性，结果表明不同试验条件下最佳的内参基因组合不相同。Yan等[11]在6个不同基因型的柑橘叶中，从7个候选内参基因中筛选出最稳定的3个内参基因，到冰糖橙的不同器官中进行验证时，也发现它们的表达差异很大且稳定性顺序与在不同基因型中的也不一致。因此根据特定的试验条件选择可靠的内参基因很有必要。于是我们基于柑橘中常用基因表达分析的要求，以湖南省特色主栽品种冰糖橙的4种不同器官（根、茎、叶、果实）及干旱、低温、溃疡病、衰退病胁迫下的冰糖橙叶片为试材，分析了6个候选内参基因的表达稳定性情况，旨在为上述各种试验条件选定稳定表达的内参基因，从而为柑橘研究中的基因表达分析提供较为可靠的内参基因。 　　1 材料和方法 　　1.1 植物材料与胁迫处理 　　1.2 方法 　　1.2.2 引物设计与合成 候选内参基因的引物来自Yan等[11]设计的引物，由上海生工合成。 　　2 结果与分析 　　3 讨 论 　　本研究的候选内参基因选自Yan等[11]在不同柑橘基因型中表达相对稳定的基因（M1.0），而且Tomas等[18]的研究表明在特定的试验条件与特定组织中表达稳定的内参基因在其同源物种的相同组织及相同试验处理下表达也相对稳定，因此本研究筛选出的枳砧冰糖橙不同组织和不同逆境胁迫下的内参基因组合也将会对其他基因型柑橘有一定参考价值。此外，前人的研究[10，19-20]， 建议根据特定的试验内容进行内参基因的选择；Tomas等[18]研究证明根据特定的试验条件筛选的内参基因，其表达稳定性强于在各种条件下表达都稳定的基因；本研究中在对所有柑橘样品进行整体分析时也发现候选内参基因的表达稳定性下降，因此为了获得较为稳定的表达分析结果，建议根据不同的试验内容进行柑橘内参基因的选