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气相色谱―质谱联用技术分析大气细颗粒物对小鼠肺组织代谢轮廓影响 　　摘 要 建立了基于气相色谱质谱联用技术（GCMS）分析大气细颗粒物（PM2.5）滴注对小鼠肺组织代谢轮廓的影响的研究方法。通过分析肺组织细胞内代谢物的变化，研究不同浓度PM2.5对小鼠肺组织代谢的毒性机制。鼻腔分别滴注0、7.5、20.0和37.5 g/L的PM2.5悬液，提取肺组织胞内物质，预处理后进行GCMS分析，结合主成分分析法（PCA）、偏最小二乘判别分析法（PLSDA）进行数据解析，通过PLSDA得分图可将不同PM2.5染毒浓度下的肺组织胞内物质明显区分。运用PLSDA载荷图及模型的变量重要性因子（VIP）值，发现了7种代谢物可作为区别不同浓度PM2.5下代谢组的潜在生物标志物，分别为丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、鸟氨酸、延胡索酸、柠檬酸、嘌呤（p0.01）。代谢途径分析结果表明，PM2.5滴注使小鼠肺组织受到氧化损伤，氧化应激反应增强，抑制了三羧酸循环（TCA循环）及嘌呤代谢。本研究为深入解析PM2.5致毒机理提供了新的方法及理论依据。 　　关键词 大气细颗粒物； 代谢轮廓； 主成分分析； 毒性机理 　　1 引 言 　　大气细颗粒物（PM2.5）是指空气动力学直径小于2.5 μm的颗粒物，含有有机/无机碳（OC/EC）、硫酸盐、硝酸盐、重金属和多环芳烃（PAHs）等多种有害物质[1，2]。PM2.5颗粒随呼吸进入人体肺泡后，可破坏肺泡组织，导致矽肺病，其携带的重金属、PAHs等可进入血液系统，危害人体健康[3]。在中国城市环境中，PM2.5中的PAHs及其衍生物是导致人体患肺癌的主要原因[4]。目前，研究PM2.5的健康效应主要采用流行病学及毒理学研究方法。流行病学研究证实，PM2.5的污染程度会影响人群的发病率和死亡率，大气中PM2.5浓度每升高10 μg/m3，人群呼吸系统疾病的死亡率从2.1%升高到3.75%[5]。PM2.5可在肺部沉积，导致慢性阻塞性肺疾病（Chronic obstructive pulmonary diseases， COPD）或肺癌[6]。目前，定量分析PM2.5剂量效应关系的研究都是基于环境流行病学研究数据，而毒理学研究结果可为流行病学研究所发现的颗粒物健康效应提供机理解释[7]。PM2.5的成分复杂，并随着时空变换而不断变化，其损伤程度和机制也会相应改变，这类研究是当今PM2.5研究中的热点。 　　代谢组学是研究健康效??的有力工具，其揭示的小分子代谢产物变化是机体内基因、蛋白质、酶等功能变化的一系列事件的最终结果，直接反映了生物体系的最终状态，可反映机体特定病理生理状态下整体代谢物质的变化，为疾病诊断、揭示致病机理提供新的研究思路[8，9]。Belén等[10]采用直接输注电喷雾电离四极杆飞行时间质谱（DIESIQTOFMS）和气相色谱质谱联用（GCMS）检测肺癌（LC）组和对照组的支气管肺泡灌洗液（BALF）代谢物差异，采用偏最小二乘法（PLSDA）分析和筛选生物标志物，发现肺癌导致谷氨酸盐和谷氨酰胺代谢途径的变化，并评估及验证了其潜在的生物标志物。Izabella等[11]对在空气污染中暴露的人肺灌洗液进行多平台代谢组学研究，结果表明，结合GCMS、液相色谱质谱联用（LCMS）、核磁共振（NMR）可检测出支气管液（BW）和支气管肺泡灌洗液中的82种代谢物，其中46种代谢物显示出由于生物柴油暴露导致的代谢差异。 　　王晓飞等[12]利用LCMS的代谢组学技术，分析了经PM2.5悬液气管滴注暴露后成年雄性大鼠睾丸代谢组的全局变化，采用偏最小二乘判别分析（PLSDA）和非参数检验进行统计分析，最终鉴定了56种差异代谢物，并发现PM2.5暴露会引起大鼠睾丸的氨基酸和核苷酸代谢紊乱、脂类代谢异常和类固醇激素代谢失衡。但该研究未对大鼠肺脏进行PM2.5毒理研究。Wang等[13]利用超高效液相色谱质谱联用技术（UPLCMS）对成年大鼠以1 mg/kg/周的剂量进行PM2.5悬液滴注，连续滴注3月后解析肺组织代谢物，发现31种代谢物含量升高、19种代谢物含量降低，通过代谢途径分析推测PM2.5可干扰助氧化抗氧化平衡，并与磷脂、甘油磷酸、鞘脂和嘌呤的变化密切相关。但该研究主要针对单一浓度下的PM2.5对大鼠肺组织的健康效应，并未研究PM2.5浓度变化对其影响。本研究通过采集PM2.5样品，并配制成不同浓度悬浮液（7.5、20.0和37.5 g/L），对小鼠进行鼻腔滴注，通过对实验组与对照组的代谢物进行主成分分析（PCA）、偏最小二乘判别分析（PLSDA），研究其对小鼠肺组织的浓度效应关系，寻找不同浓度PM2.5影响肺组织代谢的潜在生物标志物，及其对相关代谢的影响。 　　2 实验部分 　　2.1 仪器与试剂