乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法 荧光定量PCR法（征求意见稿）.docVIP

ICS FORMTEXT FORMTEXT FORMTEXT ICS XXXX FORMTEXT SN 中华人民共和国 FORMTEXT 检验检疫行业标准 FORMTEXT SN/T FORMTEXT XXXX— FORMTEXT XXXX FORMTEXT 代替SN/T 2101-2008 FORMTEXT 进出口河豚中河豚毒素检验方法 乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法 乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法 —荧光定量PCR法 FORMTEXT Determination of Mycobacterium tuberculosis - the real-time PCR method FORMTEXT FORMDROPDOWN FORMTEXT FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX发布 FORMTEXT XXXX - FORMTEXT XX - FORMTEXT XX实施 FORMTEXT 中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局发布 XX/T XXXXX—XXXX PAGE \* MERGEFORMAT 5 前 言 本标准按照GB/T 1.1-2009给出的规则起草。 本标准代替SN/T 2101-2008《乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法 荧光定量PCR法》。 本标准与SN/T 2101-2008相比，主要变化如下： ——修改了从乳及乳制品中提取结核分枝杆菌的乳液处理办法； ——增加了确证实验； ——增加了附录B（结核分枝杆菌荧光PCR 检测方法的实验室规范）。 本标准由国家认证认可监督管理委员会提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国辽宁出入境检验检疫局。 本标准主要起草人：吴斌、贾赟、刘钊、张雪、肇慧君、李叶、胡传伟 本标准所代替标准的历次版本发布情况为： ——SN/T 2101-2008。 乳及乳制品中结核分枝杆菌检测方法-荧光定量PCR法 范围 本标准规定了乳及乳制品中牛型结核分枝杆菌和人型结核分枝杆菌荧光PCR检测的操作方法。 本标准适用于鲜乳、乳粉中结核分枝杆菌的检测，其它乳制品可参照执行。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB/T 18645 动物结核病诊断技术中传统的诊断方法 GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法 GB/T 19489 实验室生物安全通用要求 SN/T 1193 基因检验实验室技术要求 GB/T 18645 动物结核病诊断技术。 3 术语和定义 3.1 实时荧光PCR real-time fluorescent PCR 实时荧光PCR是在普通聚合酶链反应的基础上，加入一条特异性的荧光探针。该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收，PCR扩增时，Taq酶的5′-3′外切酶活性将探针酶切降解，使报告基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。 3.2 Ct值 cycle threshold 每个反应管内的荧光信号达到设定的阈值时所经历的循环数，也可称为Ct值。 3.3 DNA　　 脱氧核糖核酸。 3.4 Taq酶 Taq DNA聚合酶。 3.5 Triton X-100 Triton X-100是一种非离子型去垢剂。 4 材料和试剂 4.1 仪器和器材 4.1.1 荧光PCR检测仪 4.1.2高速台式冷冻离心机。 4.1.3普通台式离心机。 4.1.4涡旋振荡器。 4.1.5 冰箱：4 ℃±1 ℃，-20 4.1.6 微量可调移液器及配套带滤芯洗头。 4.1.7 1.5ml Eppendorf管。 4.1.8 10ml 离心管。 4.1.9 一次性手套。 4.1.10 紫外灯。 4.1.11 生物安全柜。 4.2 试剂 除特别说明以外，所用试剂均为分析纯，实验用水为双蒸水。 4.2.1 4% NaOH：见附录A.1章 4.2.2 0.9%灭菌生理盐水：见附录A.2 4.2.3 20 mg/mL蛋白酶K：见附录A.3章 4.2.4 10﹪ SDS：见附录A.4章 4.2.5 pH5.2 3M 4.6 pH 8.0 TE 缓冲液：见附录A.6章。 4.2.7 结核分枝杆菌 4.3 抽样、采样工具 采样工具（棉拭子、剪刀、镊子、注射器、离心管、研钵）应经121℃±2℃ 4.4 检测引物和探针见表1。