柴胡配伍解毒化浊药对乳腺癌引经增效实验研究.docVIP

柴胡配伍解毒化浊药对乳腺癌引经增效实验研究 　　摘要：目的通过观察柴胡配伍解毒化浊药对乳腺癌的作用，探寻柴胡引经增效的机制，为中医中药抗乳腺癌肝转移提供实验依据。方法体内实验：引经中药的药物血清干预SK-BR-3 人乳腺癌细胞株，观察中药对SK-BR-3细胞凋亡及细胞周期的影响。体外实验：40只BALB/c雌性裸小鼠背部右侧皮下接种人乳腺癌MDA-MB-435细胞，7 d后随机分3组，引经中药组，中药组，生理盐水组，给药21天后称取各组裸鼠体重、瘤重、计算肿瘤抑制率，观察裸鼠肝脾组织病理HE染色。结果引经中药组阻止SK-BR-3细胞周期的G2/M期，抑制细胞的有丝分裂，减少G0/G1期细胞数量。高剂量引经中药组诱导细胞凋亡作用明显，与生理盐水组比较有显著性差异，P0.05。引经中药组抑瘤率为56.21%，中药可明显降低肿瘤和脾重量，与生理盐水组比均有显著性差异，P0.05。3组肝脏重量无明显变化，生理盐水组出现???细胞坏死和炎细胞浸润。结论柴胡通过阻止SK-BR-3细胞周期抑制增殖和诱导肿瘤细胞凋亡发挥抑制肿瘤生长的作用。柴胡能引解毒化浊药入肝脾对接种人乳腺癌MDA-MB-435细胞的裸小鼠的肝脾病变起引经增效作用。 　　关键词：引经药；柴胡；HER-2阳性；乳腺癌；肝转移 　　中图分类号：R285.5文献标志码：A文章编号：1007-2349（2015）06-0083-03 　　中国癌症研究基金会调查研究表明，乳腺癌已经成为对女性威胁最大的恶性肿瘤。乳腺癌肝转移因缺乏明确的靶向性，对化疗反应差，是影响乳腺癌预后较重要的因素。HER-2阳性乳腺癌因其生存率低、恶性程度高、易发生肝转移转移、预后差[1]，以研究乳腺癌肝转移的机制及治疗方法评估一直是乳腺癌动物模型研究的重点。中医认为肿瘤药物靶向与中医归经（引经）理论有相似性[2]，总结多年临床经验[3-6]，发现引经药柴胡对抗肿瘤中药有协同作用，本研究通过观察引经中药柴胡与解毒化浊药物协同对乳腺癌肝转移的影响，探寻中药归经与作用靶点的关系，为合理选择抑癌中药提供依据。 　　1实验材料 　　1.1细胞株人乳腺癌细胞株SK-BR-3购自上海中科院细胞所，MDA-MB-435人乳腺癌高转移细胞，浙江中医药大学动物中心提供。实验动物BALB/C雌性裸小鼠，SPF级，体重20 g±2 g，4-6周龄，购自上海斯莱克实验动物有限公司。 　　1.2药物及试剂中药组方（解毒化浊药）：黄芪、白术、茯苓、蚤休、蛇六谷、半枝莲、石上柏：引经中药组方：柴胡配伍解毒化浊药。以上中药饮片均由浙江中医药大学附属门诊部中药房提供。RPMI 1640 培养液购自美国Gibco公司；胎牛血清购自美国Hyclone 公司；Annexin V/ 碘化丙啶（propidium iodide，PI）试剂盒购自美国BD Pharmingen公司。 　　1.3实验仪器及设备CO2培养箱（伯乐公司），荧光倒置显微镜（Olympus），超净工作台（苏净），BECKMAN 流式细胞仪（BECKMAN公司），匀浆机，荧光定量PCR仪，超低温冰箱，微量核酸测定仪，冷冻高速离心机（BECKMAN公司）。 　　2实验方法 　　2.1中药含药血清的制备雌性Wistar大鼠10只，体重（180±20）g，随机分组5组，每组2只。实验共分5组：中药低剂量组、引经中药低剂量组、中药高剂量组、引经中药高剂量组、生理盐水组。中药低剂量组2.68 g/kg/d，灌胃，每天1次，每次2 mL；引经中药低剂量组、2.83 g/kg/d，每次2 mL；中药高剂量5.36 g/kg/d，灌胃每天1次，每次2 mL；引经中药高剂量组5.66 g/kg/d，每次2 mL；生理盐水组给等量生理盐水，灌胃，每天1次，每次2 mL，连续4天取动物血清。 　　2.2裸鼠移植瘤模型建立及分组取对数生长期的MDA-MB-435细胞，0.25%胰酶消化后，无菌PBS漂洗细胞2遍，离心，用无血清的DMEM/F12 培养基重悬细胞，调整细胞数为1×107 /mL，每只BALB/c 裸鼠用1 mL注射器接种200 μL细胞悬液于其背部右侧皮下。细胞接种7d后，测量肿瘤随机分组。本实验共分3组：中药组、引经中药组、生理盐水组。中药组，每只裸鼠灌胃每天两次，每次0.3 mL；引经中药组，灌胃每天两次，每次0.3 mL；生理盐水组给等量生理盐水，灌胃每天早晚两次，每次0.3 mL。给药时间均为21 d。 　　2.3标本取材用药后第21 d，将小鼠脱颈处死，取肿瘤瘤块、肝和脾脏，分别称重。将肝组织分别放入10%中性甲醛固定，做HE染色。 　　3观察指标及统计方法 　　3.1引经中药对人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞凋亡的影响AnnexinV-FITC/PI法细胞