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桑黄多糖分离纯化及体外免疫活性研究 　　摘要：利用层析技术对桑黄子实体水提醇沉粗多糖进行了分离纯化，获得不同的组份。采用体外刺激小鼠脾淋巴细胞增殖试验对各组份进行了体外免疫活性的检测，结果表明，水提醇沉的各级粗多糖均有不同程度的体外刺激淋巴细胞增殖的作用；经过离子柱层析分离后，PIP30得到的各组份均是有活性的，PIP60得到的各组份中，P60W和P60S2活性较好，P60S1无活性；分别将P60W和P60S1进行了凝胶柱层析得到均一多糖P60W1-1和P60S1-1，免疫活性比较结果表明P60W1-1有活性，P60S1-1无活性，说明有活性的均一多糖必须要从有活性的粗多糖中去分离纯化获得。?? 　　关键词：桑黄；?A多糖；?A分离纯化；?A体外免疫活性?? 　　文献标识码：S567.39; R284.2; R285.5??A 　　 　　桑黄[Phellinus igniarius(L.∶Fr.)Quél.]是一种珍贵的药用真菌，其子实体入药，味微苦，能利五脏、软坚、排毒、止血、活血等[1]。桑黄的主要化学成分为多糖，研究表明桑黄多糖具有抗肿瘤及其它多种生物功能[2～7]，其抑瘤作用可能是通过增强机体免疫功能而产生的，毒副作用低，属于生物反应调节剂的一种[8]。目前，国内外对桑黄的研究大多以桑黄提取物或桑黄粗多糖为研究对象，对桑黄多糖分离纯化物的生物活性研究较少。本研究对人工栽培的桑黄子实体水提醇沉粗多糖进行了分离纯化，并对每一步分离得到的桑黄粗多糖各组份和纯多糖进行了体外促进小鼠脾淋巴细胞增殖作用的研究，旨在为进一步开发利用桑黄多糖奠定理论基础。?? 　　 　　1 材料和方法 　　 　　1.1?Σ牧? 　　人工栽培的桑黄（Phellinus igniarius）子实体购于黑龙江绿源公司。?? 　　1.2?κ约? 　　植物凝集素（PHA）为Sigma公司产品；青霉素、链霉素、二甲基亚砜（DMSO）为Amresco公司产品；RPMI-1640细胞培养基、胎牛血清（FBS）为Gibco公司产品；其他试剂均为国产分析纯。?? 　　1.3?ι；拼侄嗵堑奶崛》掷? 　　取干燥的桑黄子实体3 kg，粉碎，用10倍体积95%乙醇室温浸提过夜、过滤，重复操作2次，醇提后残渣置阴凉通风处风干，于50 L的提取罐中，加10倍体积蒸馏水，沸水提取2 h，重复提取3次，合并水提取液，减压浓缩，4000×g离心，去除沉淀。上清液在搅拌下缓缓加入95%乙醇，至乙醇浓度达30%，静置过夜，4000×g离心，沉淀物用蒸馏水溶解，放在100 ℃水浴锅上将乙醇彻底挥尽后冷冻干燥，得粗多糖PIP30；醇沉上清液中继续加入95%乙醇至乙醇浓度达60%，静置过夜，4000×g离心，沉淀的处理步骤同上，得粗多糖PIP60；醇沉上清液中继续加入95%乙醇至乙醇浓度达80%，同上述步骤处理得到粗多糖PIP80。?? 　　1.4?Υ侄嗵堑囊趵胱咏换恢?层析 　　取粗多糖PIP30、PIP60样品，分别溶于蒸馏水中，配制成20 mg/mL的溶液，10000×g 离心??10 min，取上清液上DEAE-Sepharose Fast Flow离子柱层析（26 mm×100 cm），采用Amersham Bioscience的AKTA prime层析系统，先以蒸馏水洗脱，再以0～2 mol/L的NaCl梯度洗脱，流速4 mL/min，以苯酚硫酸法检测糖峰。分别收集各洗脱峰部位的洗脱液，透析脱盐，浓缩后冷冻干燥。?? 　　1.5?Χ嗵堑哪?胶柱层析 　　将离子交换柱层析分离得到的样品配成??20 mg/mL的溶液，过凝胶柱(26 mm×??100 cm)层析，采用AKTAexplorer层析系统（Amersham公司），填料为Sephacryl S400 HR系列,洗脱液为蒸馏水，流速1 mL/min，上样体积5 mL，分部收集，体积为10 mL/管，示差折光检测器检测。分别收集每个糖峰组份，再反复过凝胶柱纯化。?? 　　1.6?κ匝檠?品的配置 　　将待测的样品用分子量截留范围为8000～12000的透析袋充分透析，除去其中所含的盐及小分子物质，冷冻干燥后，精确称取多糖样品于1.5 mL 无菌Eppendorf离心管中，用PBS缓冲液配置成浓度为10 mg/mL的母液，充分溶解后15000×g离心30 min，无菌条件下转移上清液至新的无菌Eppendorf管中，将样品稀释成不同的浓度梯度进行体外淋巴细胞增殖作用的实验。?? 　　1.7?μ逋獯碳ち馨拖赴?增殖试验 　　1.7.1?π∈笃⒘馨拖赴?的制备 　　取8～10周龄大的雄性BALB/C小鼠，颈椎脱臼处死，取脾脏，用PBS缓冲液冲洗3~4次。用100目筛在培养皿中将脾脏磨碎，磨碎