柔嫩艾美耳球虫核糖体蛋白S3a基因克隆及分析.docVIP

柔嫩艾美耳球虫核糖体蛋白S3a基因克隆及分析 　　摘要：根据GenBank中收录的柔嫩艾美耳球虫核糖体蛋白S3a基因序列，利用计算机软件设计1对引物，从纯化的柔嫩艾美耳球虫第2代裂殖子中提取总RNA，然后应用RT-PCR技术扩增出约810 bp的产物，将其连入pMD18-T载体，经双酶切和PCR鉴定正确后，进一步进行DNA序列测定。将本研究测序结果与GenBank收录的柔嫩艾美耳球虫S3a基因进行比对，发现两序列间有6个碱基发生突变，其中3个为无义突变，其余为有义突变，同源性为979%；本研究扩增的S3a基因包含了一个全长795 bp的完整开放阅读框（ORF），编码264个氨基酸，蛋白分子量约为29.9 KD，ORF碱基同源性为99.0%，推导氨基酸序列同源性为98.1%。将本研究克隆的核糖体蛋白S3a基因与GenBank中收录的人和哺乳动物、植物、真菌、禽鸟等共15种真核生物的核糖体蛋白S3a基因进行比对发现，虽然本研究克隆和GenBank中收录的柔嫩艾美耳球虫S3a基因之间同源性最高，但是两者却与硕大利什曼原虫和布氏锥虫这2种原虫的S3a基因同源性较低，反而与禽鸟S3a基因的同源性较高。 　　关键词：柔嫩艾美耳球虫；S3a基因；克隆；分析 　　中图分类号： Q785文献标志码： A 　　文章编号：1002-1302（2016）12-0068-03 　　收稿日期：2015-09-27 　　基金项目：国家自然科学基金（编号；江苏省自然科学基金（编号：B。 　　作者简介：仇保丰（1978―），男，安徽长丰人，博士，兽医师，从事动物及动物产品病原体的检测及研究。Tel：（0513E-mail：baofengqiu2008@163.com。 　　通信作者：宋鸿雁，博士，副教授，研究方向为实验动物学。E-mail：songhongyanv@。 　　鸡柔嫩艾美耳球虫（Eimeria tenella）S3a基因是从E. tenella第1代裂殖体λ ZapⅡ cDNA 文库中筛选出来的1种核糖体蛋白（EtS3a）基因，由于它与具有调节细胞周期进程和参与蛋白合成的哺乳动物核糖体蛋白fte-1、植物核糖体蛋白cyc-07和酵母菌核糖体蛋白MFT1均具有较高的同源性，且其mRNA仅在E. tenella裂殖体和裂殖子阶段能够检测到，故而推测EtS3a可能在激发E. tenella裂殖子和裂殖体发育、黏附和侵袭宿主细胞、适应环境变化等过程中发挥重要的调节作用[1]。除此之外，Cordeiro-Da-Silva等在研究中发现，硕大利什曼原虫（Leishmania major）的S3a蛋白还具有调节T细胞和B细胞活性，参与免疫调节的作用[2]。Zemzoumi等报道硕大利什曼原虫S3a蛋白可由胞内转运至胞外，并与被膜结合，具有保护抗原的特性[3]。但截止目前，国内外尚未发现关于E. tenella S3a基因克隆和分析的研究报道，这对进一步研究E. tenella S3a蛋白的生物学功能和免疫学意义等造成不利影响。本研究通过对鸡E. tenella江苏分离株的S3a基因进行克隆和分析，为相关研究工作者提供参考。 　　1材料与方法 　　1.1试验材料 　　1.1.1球虫卵囊E. tenella卵囊分离自江苏某鸡场，由南通出入境检验检疫局有害生物检疫实验室鉴定并保存。 　　1.1.2试验鸡1日龄AA肉鸡购自江苏南通某商品鸡孵化场，饲养于严格消毒无球虫的笼舍中，饲喂的饲料中不含抗球虫药。 　　1.1.3试剂DEPC，购自Amresco公司；M-MLV和Oligo（dT）15 Primer，购自Promega公司；pMD18-T克隆载体、Taq DNA聚合酶、dNTP、DL2 000 Marker、限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ和DNA胶回收试剂盒，均购自宝生物工程（大连）有限公司。 　　1.2试验方法 　　1.2.1引物设计和合成根据GenBank中收录的E. tenella S3a基因序列，利用Primer Premier 5.0软件设计1对扩增引物：S3a-F，5′-A[ZZ（Z]GGATCC[ZZ）]ATGGCGGTCGGTAAGAACAAG-3′；S3a-R，5′-TT[ZZ（Z]GAATTC[ZZ）]TCAGACAGAGTCTTGCACAG-3′，画线部分为BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。 　　1.2.2cDNA模板的制备30只1日龄AA肉鸡饲养至14日龄，经口接种新鲜孢子化卵囊1×105 个/羽，接种后120 h杀鸡取盲肠。参考文献[4]的方法分离和纯化E. tenella第2代裂殖子，再采用一步法[5]提取