酶工程环保酶制剂生产与应用中国石油大学环境生物工程.pptx

一、酶的生产;2.微生物作为酶源的优势 　1）易得到所需的酶类 　2）易获得高产菌株 　3）生产成本低 　4）微生物生长周期短 　5）生产易管理 　6）提高微生物产酶能力的途径较多 　7）可提高酶产量或改造酶;3.对酶生产菌的要求 　1）不是致病菌，也不产毒素 　2）不易变异退化，不易感染噬菌体 3）产酶量高，而且最好产生胞外酶 4）原料廉价，周期短，易培养;二、酶的分离纯化;酶分离提纯步骤如下：;1.酶提取 　　　定义：是将酶从生物组织或细胞中以溶解状态释放出来的过程，以供进一步从中分离纯化出所需的酶。 1）组织及细胞的破碎 　（1）物理法（包括机械法） 　（2）化学法 　（3）酶解法 　2）酶的提取 　原理———相似相溶 　常用方法： 　（1）酸、碱、盐溶液提取 　（2）有机溶液提取;2．酶分离纯化的沉淀技术;　蛋白质的溶解度与溶液中的离子强度遵守Cohn方程： 　　;（2）影响因素 　a.蛋白质的浓度 b.介质的pH c.温度 d.盐类型;2）PEG（聚乙二醇 ）沉淀法———溶解度的差异 　（1）基本原理 　　空间排阻学说：PEG分子在溶液中形成网状结构，与溶液中的蛋白质分子发生空间排挤作用，从而使蛋白质分子凝聚而沉淀下来。 PEG沉淀蛋白质的过程遵循下列方程：;（2）影响因素 a. 蛋白质的分子质量——大，沉降好 b. 蛋白质浓度 c. pH值 d. 离子强度 e. 温度 f. PEG聚合度;3)有机溶剂沉淀法——溶解度的差异 （1）基本原理 　a.介质的介电常数下降，增强静电作用力 b.降低水合程度 （2）常用方式 　　a.分级沉淀有用的蛋白质 b.杂蛋白质变性 （3）缺点——易使酶变性，低温操作;4）等电点沉淀法——溶解度的差异 　　蛋白质在等电点（ｐI）处，净电荷为0，易于沉淀。 5）热变性沉淀法——热稳定性的差异 　　可用其他辅助因子、底物等方法，使目的酶的热变性温度提高。;3.酶分离纯化的层析技术;1）凝胶过滤层析——分子大小和形状的差异 （1）基本原理 　酶液中各组分按相对分子质量从大到小的顺序先后流出层析柱，从而实现分离纯化。 （2）优点 　　条件温和，操作简便，分离范围广，回收率高，层析柱可反复使用，无需再生处理,可分段分离。 （3）常用的凝胶 　　交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶;2）离子交换层析——电荷性质的差异 　　它利用离子交换剂上可解离基团对各种离子的亲和力不同而进行分离。 　（1）基本原理 　　蛋白质是两性电解质，不同蛋白质由于其pI不同，在同一种pH值介质中电离状况不同，分子所带电荷种类和数量就不同，与离子交换剂的静电吸附能力也不同。通过吸附和改变离子强度或pH值解吸洗脱，可使蛋白质依据其静电吸附能力由弱到强的顺序而分离开来。;（2）洗脱方法 　a.梯度洗脱 　b.阶段洗脱;3）亲和层析——亲和力的差异 （1）基本原理 　利用配基与酶结合能力而将目的酶分离出来。;（2）载体 a.应具有均一、坚实、多孔的网状结构 b.亲水 c.具有可活化和改变的化学基团 d.具有良好的化学稳定性 交联琼脂糖凝胶;(3)配基 　a.配基与酶的亲和力 　b.配基与载体的结合方式 　　引入手臂可避免配基在载体上密度太大而造成的空间障碍。 　　W-氨烷基化合物 ;;4）高效液相色谱（ HPLC ） （1）基本原理 　用检测器检出，由收集器收集同一色谱的目的酶。 HPLC的优点： 　　分辨率高；快速，整个分离过程仅几十分钟；灵敏度高；一根术可分析多个样品，而无需重新填装柱。;4.酶分离纯化的电泳技术;1）聚丙烯酰胺凝胶电泳 （1）基本原理 　a.蛋白质的静电荷 b.蛋白质的分子大小 （2）分类　　;a. 连续凝胶电泳 　　采用相同浓度的单体和交联剂，用相同pH值和相同浓度的缓冲溶液制备成连续均匀的凝胶，然后在同一条件下进行电泳。 　　　按分子大小和净电荷的不同而具有不同的迁移率，从而彼此分开。;b.不连续凝胶电泳 　是指凝胶孔径大小、缓冲液成分及pH均为不连续的，并在电场中形成不连续的电位梯度，从而使样品浓缩成一个极窄的起始区带。 可提高分辨率的三个物理效应： 　浓缩效应；分子筛效应；电荷效应 组成： 　由上至下分别为：样品凝胶；浓缩凝胶；分离凝胶;c.浓度梯度凝胶电泳 　　　聚丙烯酰胺浓度由上至下形成由低到高的连续梯度，其内部孔径也逐渐减小。 　　适用于测定蛋白质的分子质量;d.SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS－PAGE） 　加入1%~2%的SDS（十二烷基硫酸钠 ）制备而成。 　 SDS－PAGE主要用于测定蛋白质的分子质量。 　基本原理： 　　　SDS－蛋白质复合物中SDS含有大量阴离子，从而掩盖了蛋白质之间原来的电荷的差