流式细胞仪原理及应用hiv图文.pptxVIP

白细胞的组成白细胞的组成及其分化抗原白细胞在分化成熟过程中，不同的发育阶段和不同亚类的白细胞出现或消失的表面标记，这是区分白细胞的重要标志。1986年世界卫生组织命名委员会建议应用CD系列来统一命名白细胞分化抗原 SHA- LFR0324N 13E for Jerel体液免疫和细胞免疫的作用中和抗原：形成免疫复合物，被吞噬细胞清除（条理作用）、毒素中和作用、感染中和作用细胞毒性T淋巴细胞;分泌穿孔素、IFN、、TNF等。特点：MHC-1类分子限制、直接接触、反复杀伤抗体依赖的细胞介导的细胞毒作用自然杀伤细胞（NK)：抗体依赖细胞介导的细胞毒作用、淋巴因子介导细胞毒作用、补体系统的活化（经典、凝集素、替代途径）。作用（溶胞作用、吞噬条理作用、趋化性、 炎症反应等）淋巴因子依赖的细胞毒作用免疫应答的过程及Th细胞的作用 免疫应答：细胞免疫体液免疫Th细胞作用：Th1分泌IL-2、INF等，前者可诱导Th、Tc分裂增值； Th2分泌IL-4、IL-5,可使B细胞活化，产生抗体B细胞完全活化需要Th帮助 流式细胞仪原理流式细胞术(Flow cytometry)对于处在流动状态的细胞或生物颗粒同时进行多参数的快速的分析和定量的技术BD公司HIV领域流式细胞仪产品FACSCalibur流式细胞仪FACSCount流式细胞仪流式细胞仪检测原理及在T细胞分析中应用CD3CD3TTCHCD4CD8IncubateAnalyze激发光源与荧光标记物FACSCalibur流式细胞仪仪器结构液流系统光学系统激光光源光收集系统电子系统光电转换数据处理系统软件系统液流系统-鞘液流式细胞仪原理Injector Tip鞘液荧光信号及前向角、侧向角散射光聚焦的激光光束 光学系统激光 (Laser, light amplification by stimulated emission of radiation)是一种相干光源，它能提供单一波长、高强度及稳定性高的光照激光波长: 488nm, 635nm检测信号 散射光信号 FSC:前向角散射光 SSC:侧向角散射光(90度散射光) 荧光信号 荧光染料 光学滤片检测信号LaserFALS Sensor前向角散射光信号 前向角散射光信号 散射光信号—前向角散射光信号(FSC)FSC----Forward (Angel Light) Scatter 在激光束正前方的检测器, 为前向散射光检测器 FSC的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关FSC用于检测细胞或其他粒子的表面属性 如:大小 LaserFALS Sensor90LS Sensor侧向角散射光信号侧向角散射光信号 侧向角散射光信号(SSC)SSC-Side (Angel Light) Scatter 与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器, 也称为90度散射光检测器 SSC的强度与细胞或其他颗粒的大小, 形状及 optical homogeneity 有关SSC用于检测细胞内部结构 如:胞浆内颗粒多少, 核质比 流式细胞仪的检测信号：散射光Right Angle Light Detector ? Cell ComplexitySSCIncident Light SourceForward Light Detector ? Cell Surface Area FSCFSC，前向角散射光，代表细胞大小SSC，侧向角散射光，代表细胞粒度荧光信号每种荧光染料均有特定的激发波长, 并激发后会有发射波长,流式细胞仪检测的即是它特定的发射波长. 利用各种不同波长的光学滤片来收集(检测)这些光学信号光学系统FCM的光学系统是由若干组透镜, 滤波片, 小孔组成光路 - 滤片特性 长通滤片 – 允许长于设定波长的光通过 短通滤片 – 允许短于设定波长的光通过 带通滤片 – 允许一定带宽的波长通过光学滤片 长通 短通 带通460 500 540460 500 540460 500 540BP500/50LP 500SP 500荧光信号荧光信号 光路 - 滤片特性 当以 45o 角放置长通滤片时,该滤片可以通过一定波长的光,同时也可以阻断并折射该波长以下的光 这种方式的滤片称为二向色性长通滤片( dichroic filter) 光学系统电子系统当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时, 受激激发, 产生代表细胞内不同物质、不同波长的荧光信号, 这些信号经A/D转换成数字信号, 送计算机进行储存、 作图、 统计分析发射波长PEPerCP