致病性嗜水气单胞菌PCR检测技术规程（编制说明）.docVIP

《致病性嗜水气单胞菌PCR检测技术规程》 编制说明 1 标准的目的和意义 嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）属于气单胞菌科气单胞菌属，是一类广泛存在于水环境的常在菌，它不仅能引发多种水生动物的传染病，而且也是爬行类、两栖类、鸟类以及哺乳类等多种动物的重要病原菌，是我国淡水养殖鱼类暴发性败血症的主要病原。近年来大量材料证明，嗜水气单胞菌亦可单独或与其它致病菌共同感染，引发人类的腹泻或败血症等病症，影响食品安全。因此，嗜水气单胞菌已成为人兽鱼共患病原菌，其公共卫生学意义也日益受到广泛重视。 嗜水气单胞菌的毒力差异较大，有致病菌株与非致病菌株之分。国内外学者普遍认为，嗜水气单胞菌的致病性与其胞外产物即毒力因子密切相关，因此建立毒力基因的多重PCR检测方法是检测该致病菌比较可取的方法。目前已确定的嗜水气单胞菌的毒力基因主要有气溶素基因（are）、溶血素基因（hly）和丝氨酸蛋白酶基因（ahp）。嗜水气单胞菌携带一种毒力基因就可表现出致病性，因此只针对单个毒力基因建立的PCR方法可能存在漏检。此外，aer、hly和ahp不具有种属特异性，气单胞菌属的其它细菌也可能有这些毒力基因，而且基因的序列同源性比较高，所以只针对毒力基因进行检测而不进行种的鉴定会导致误检。因此，建立能同时检测嗜水气单胞菌16S rDNA（种的鉴定）及其多个毒力基因的多重PCR检测标准和方法，不仅可以鉴定嗜水气单胞菌，还可同时区分致病性与非致病性菌株，对致病性嗜水气单胞菌的诊断、检疫、防疫都具有重要意义。据此，广西质量技术监督局向我所下达了《致病性嗜水气单胞菌PCR检测技术规程》广西地方标准的制定任务（桂质监函〔2010〕936号），实施时间为2010～2011年。 项目由广西水产研究所水产品质检中心（广西渔业病害防治环境监测和质量检验中心）承担。中心拥有各种大型仪器设备85台（套），通过了国家和省级计量认证，长期从事水生动物病害等方面的检测和研究工作。近几年来，项目组主要成员一直开展嗜水气单胞菌的分离、检测和研究工作，从发病水生动物中分离鉴定并保存了多株嗜水气单胞菌，为致病性嗜水气单胞菌检测标准的制定打下了重要基础。 2 标准起草工作简况 2010年12月，任务落实后，广西水产研究所成立该标准编制小组，由黎小正副所长（农业部渔业产品质量监督检验测试中心主任）担任组长，成员有韦信贤、吴祥庆、童桂香。为了使制定的标准具有科学、规范和可操作性，并按时完成，编制小组专门制定了《致病性嗜水气单胞菌PCR检测技术规程编制工作方案》。 2011年1月～4月，根据工作方案和任务要求，广泛查询和收集资料、开展调查和深入研究。参考国内同类相关国家标准和行业标准的制定情况，充分借鉴、吸收标准规范的成果；采购试剂、复苏菌株、提取细菌DNA，进行嗜水气单胞菌四重PCR检测，初步建立致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法。 2011年5月～7月，对致病性嗜水气单胞菌多重PCR检测方法的反应条件进行优化、筛选，调整多重PCR中反应因子的浓度，确定检测方法最佳的反应体系及反应条件。 2011年8月～10月，对检测方法进行特异性、敏感性、重复性等多方验证，汇总、分析实验数据，并通过对多株气单胞菌的检测验证方法的适用性，进行方法的可行性评价，完成标准征求意见稿。 2011年11月，送专家征求意见。标准征求意见稿完成后，分别向在检验检疫、科研、教学、技术推广等方面有实际经验和较高理论水平的专家征求意见。 2011年11月～2011年12月，根据征求意见稿反馈意见，编写小组逐一对标准的条款进行修改、补充和完善，必要时将对方法进行进一步验证、优化，完成标准送审稿。在编写的规则上，严格按照《标准化工作导则》的要求进行。最后，确定检测方法，制定、完善标准操作程序，申请标准验收，完成标准报批稿。 3 标准确定所遵循的原则 3.1 政策性原则：本标准编制的每一项内容都遵循国家有关的法律、法规和规章制度。 3.2 先进性原则：本标准是在国内没有类似标准的前提下提出的，因此制定具有先进性。 3.3 适用性原则：本标准操作规程容易掌握，适用于具备相应实验条件的检验检疫人员。 3.4 协调统一性原则：本标准是以GB/T 18652-2002《致病性嗜水气单胞菌检验方法》及其他多重PCR检测标准作为指导、依据和参考的前提下制定，所以与其它标准协调统一。 3.5 规范化原则：本标准的制定按照GB/T 1.1-2009《标准化工作导则 第一部分：标准的结构和编写规则》来编写。 4 标准的主要内容 本标准借鉴GB/T 18652-2002《致病性嗜水气单胞菌检验方法》的细菌分离步骤及其他多重PCR检测方法，结合广西致病性嗜水气单胞菌检验检疫需求而制定。编写内容包括适用范围、规范性引用文件、术语及定义