海带表面降油细菌分离鉴定及降油性能研究.docVIP

海带表面降油细菌分离鉴定及降油性能研究 　　摘要：用柴油为唯一碳源的培养基选择分离海带表面具有降解柴油性能的细菌；对分离菌株进行了形态学、生理生化特性以及16SrDNA序列分析并测定其生长特性；测定了接菌不同浓度（7×10??7 cfu/mL、7×10??8 cfu/mL、7×10??9 cfu/mL）分离菌对柴油的降解率；另外，测定了加入不同浓度葡萄糖（0.5 g/L、1 g/L、2 g/L、4 g/L、6 g/L、8 g/L、10 g/L）作用7 d后分离菌对柴油的降解率。结果显示：从海带表面分离到2株降油细菌，编号为：HD-4和HD-6。HD-4菌株菌落形态圆形、直径1.5 mm、黄色、不透明、边缘整齐，HD-6菌株菌落圆形，直径1.0 mm，浅黄色、透明、边缘整齐。两株菌均为革兰氏阴性短杆菌。生理生化特征和16SrDNA序列分析确定HD-4菌株为假交替单胞菌（??Pseudoalteromonas sp.??），其16SrDNA同源性为99%；HD-6菌株为交替单胞菌（??Alteromonas_sp.??），其16SrDNA同源性为98%。2株菌最适生长温度均为15 ℃。HD-4 和HD-6最适生长pH分别为9和8。适宜NaCl浓度分别为 2%和4%；在25 ℃振荡培养（150 r/min）7 d，接菌量为7×10??7 cfu/mL、7×10??8 cfu/mL、7×10??9 cfu/mL 时，HD-4对柴油的初始降解率分别为8??0%，22.1%和27.6%；HD-6初始降解率分别为23.7%、38.8%和43??2%。加入葡萄糖后2株菌的降油率均有所增高，加入4 g/L葡萄糖时达最高值，3个接种浓度下HD-4菌株分别为85.4%、82.3%和80.4%，HD-6菌株分别为86.8%、93.7%和89.3%。当接菌量为7×10??7 cfu/mL，HD-4在葡萄糖含量为4 g/L 时作用7 d，降油率可达到最大值86.72%，HD-6菌株在葡萄糖浓度6 g/L达到最大值67.64%。葡萄糖浓度超过4 g/L和 6 g/L时HD-4和HD-6菌株的降油性能有所下降。 　　关键词：石油降解菌；海带；细菌鉴定；降油性 　　近年来，经济的高速发展使得对能源需求日益增加，而以化石能源为主的能源结构带来了海洋石油开采和海上石油运输行业的大规模发展，而在石油开采、运输过程中导致的海洋石油类污染随之成为世界性的问题。根据国际海事组织的统计，全球每年流入海洋的石油数以千万吨计????［1］??，特别是在一些海湾，由于其独特的半封闭水域特征，溢油事故一旦发生就将会导致可怕的生态危机????［2］??。据联合国有关组织统计，每年由于海上油井井喷事故和油轮事故造成的溢油高达220万t????［3］??。如何治理和修复被石油污染的海洋环境及被其破坏的生态系统已经成为当下研究的热点。微生物修复是目前研究最多、应用也最为广泛的一种生物修复方法。国内外众多研究者对清除石油污染微生物的筛选鉴定、生长特性、菌株选育、降解原理、降解性能、影响因素等方面进行了大量研究????［4-8］??。目前有报道从耐受石油污染的小型藻类如蓝藻和大型藻类如江篱上筛选降解石油微生物进行研究。Radwan????［9］??等发现，大量的石油分解菌附着于多种大型海藻上, 这种藻菌共同作用对石油类污染物的降解有明显效果。本研究通过分离海带表面的附着微生物，并从中筛选出具有降油性能的菌株，为制备用于海洋石油污染修复的复合菌剂提供菌种，同时也为探索以海洋大型藻类为载体强化定植降油细菌用于海洋环境的石油污染修复奠定基础。 　　1实验材料与方法 　　1.1样品来源和培养基 　　海带样品采自大连黑石礁潮间带，菌株初筛选用2216E固体培养基，复筛选用柴油平板培养基，测量菌种柴油降解率选用基础无机盐培养基????［4］??。 　　柴油平板培养基：基础无机盐培养基 1000 mL、吐温80 1 mL、琼脂粉15 g、0号柴油10 mL (市售0号柴油，121 ℃高压灭菌后待用)，pH 7??2，121 ℃高压灭菌20 min。 　　基础无机盐培养基：氯化铵 0.5 g、氯化钠 20 g、磷酸氢二钾 1 g、磷酸二氢钾 0.5 g、硫酸镁 0.5 g、氯化钾 0.1 g、硫酸铁 0.01 g、氯化钙 0.002 g、纯水 1 000 mL，pH 7.2，121 ℃高压灭菌20 min。 　　1.2降油细菌的分离和纯化 　　首先将刮取的海带表皮组织样品置于5 mL灭菌离心管中，加入2 mL无菌生理盐水并用匀浆器匀浆，对匀浆进行梯度稀释（10????-1??、10????-2??、10????-3??、10????-4??、10????-5??），各取稀释度为0.1 m