液相色谱―串联质谱法测定人血浆中氯吡格雷酸浓度及意义.docVIP

液相色谱―串联质谱法测定人血浆中氯吡格雷酸浓度及意义 　　摘要：目的：探讨利用高效液相色谱-质谱联用法进行人血浆中氯吡格雷酸浓度测定的临床意义。方法：对血浆样品进行测定，首先在样品中加入内标物质美利曲辛，然后利用乙腈沉淀蛋白进行提取。并与健康男性受试者口服硫酸氢氯吡格雷受试制剂的血药浓度进行生物等效性比较。结果：利用高效液相色谱-质谱联用法测定人血浆中氯吡格雷酸，其回收率为97.2%-103.9%。结论：利用高效液相色谱-质谱联用法对人血浆中的吡格雷酸的浓度进行测定，具有较高的灵敏度，适用于临床上氯吡格雷片的药代动力学研究。 　　关键词： 氯吡格雷；高效液相色谱-质谱联用法；药代动力学 　　氯吡格雷是一种常用的抗血小板凝集及抗血栓药物，其主要成分为噻吩并吡嗪类衍生物。这是一种经过口服可在人体内快速吸收的药物，代谢速度较快，其在人体内的代谢产物主要是氯吡格雷酸[1]。氯吡格雷原型在人体内的浓度非常低，据相关文献报道，实验者在口服硫酸氢氯吡格雷75 mg 后对体内氯吡格雷酸的浓度进行测定，其在人体内地最大浓度（Cmax）仅为1010g[2]。国内外关于氯吡格雷血药浓度测定的相关文献较少，本文为了研究液相色谱-串联质谱法对人血浆中氯吡格雷酸的浓度测定的意义，具体研究如下： 　　1 仪器与试剂 　　本次试验选用的质谱仪为Agilent6410 型三重四极杆质谱仪，该类质谱仪配套有电喷雾离子源，另外选用的色谱仪为Agilent1200 型高效液相色谱仪。后期数据分析选用的软件为美国安捷伦公司生产的Agilent Mass Hunter Quatitative Analysis 。另外还有相关的分析天平（万分之一、FA2204N）、高速台式冷冻离心机（Happy-TL16）以及MTN-2800W 型氮吹浓缩仪[3]。（试剂：硫酸氢氯吡格雷对照品：USP LOT G1K326乙腈、醋酸铵：Dikma Technology（色谱纯）；甲醇：天津市科密欧化学仪器试剂有限公司（色谱纯）[4]。 　　2 方法与结果 　　2.1 色谱/质谱条件：色谱柱为（ 4. 6 mm × 100 mm，2. 7 μm、Dikma），流动相为浓度0.4%甲酸。甲酸与乙腈的比例为30比70，色谱柱的温度为30℃。进样量设定为50 μl，所采用的离子源为电喷离子源。干燥气流速度设定为12. 0 L /min，温度设定为350 ℃，雾化器压力为55 psig； 四极杆温度为100 ℃； 毛细管电压为4. 0 KV。 　　2.2溶液配制 　　对照品溶液：精密称取硫酸氢氯吡格雷13.54mg（换算成氯吡格雷为10.25mg），于100ml的量瓶中溶解，定容，摇匀，备用，甲醇最终制成浓度为102.5 μg/ml的氯吡格雷储备液。先后精密移取一定量的氯吡格雷储备液进行稀释，配制成一系不同浓度溶液，浓度先后为50. 4、151. 2、201. 6、1 008. 0、3 024. 0、4 032. 0、10 080. 0、30 240. 0、80 640. 0、1 00 800. 0 pg /ml。精密称取地西泮对照品10. 04 mg（相当与10.03mg的地西泮）置于100ml的量瓶中进行溶解，定容，充分混匀，备用。此为内标溶液。最终浓度为100. 3 μg /ml 的地西泮，需要进行低温保存，保存温度为4 ℃。精密移取1.0ml的地西泮内标储备液，置于50ml的量瓶中，定容，摇匀，此次选取的溶解液为甲醇?C水（ 1∶ 1） 溶液，充分混匀，此为地西泮内标溶液Ⅱ，浓度为2. 0 060 μg /ml。精密量取上述配比所得内标溶液Ⅱ2. 5 ml，置于100ml量瓶中，定容，摇匀，进行第三次稀释，所选取的稀释液仍旧为甲醇?C水（ 1∶ 1） 溶液，最终得到浓度50. 150 ng /ml 的内标溶液。 　　2.3血浆样品的处理 　　对于采取的血浆样品需要进行处理，首先需要量取空白血浆500μl，要进行精密量取。将空白血浆进行离心处理，血浆置于10ml的离心管，分别加入甲醇- 水（ 1∶ 1） 溶液、内标溶液、50 mmol /L 醋酸铵溶液，剂量分别为50μl、50μl以及500μl。将以上混合液进行涡旋混合，再加入3ml的甲基叔丁基醚，进行充分震荡，时间8min左右，然后在5℃下进行离心，离心速度为1000转/分钟，时间6min。将有机层治愈离心管中，35℃水浴中进行吹干，大约留取200 μl 流动相溶液复溶，进行涡旋混合，精密称取50 μl 样本分析[5]。 　　2.4专属性试验：实验显示氯吡格雷和内标的保留时间分别为3. 7 和2. 7 min，说明血浆中的内源性物质不干扰氯吡格雷的测定。进行液相色谱-串联质谱法测定人血浆中氯吡格雷酸，其回收率为9