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海洋分枝杆菌荧光定量PCR检测方法建立 　　海洋哺乳动物是哺乳类中适于海栖环境的特殊类群，通常被人们称作为海兽。是海洋中胎生哺乳、肺呼吸、恒体温、流线型且前肢特化为鳍状的脊椎动物。海洋哺乳动物主要包括鲸目 （Cetacea）、鳍脚目（Pinnipedia）和海牛目（Sirenia）。我国现有各种海兽39种。都是从陆上返回海洋的，属于次水生生物，属游泳生物。海洋分枝杆菌的传统检测方法有染色镜检、细菌培养、动物实验、PPD皮下实验等。这些传统方法费时费力，在实际工作中具有一定的局限性。自从1993年，Higuchi等报道实时荧光定量PCR技术以来，因其具有全封闭单管扩增、简便快速、重复性好、无扩增后处理步骤（减少扩增产物污染的可能性）、且易于自动化等优点，使其在医学、动植物、微生物学等领域受到青睐，成为当今研究病原体鉴定最热门的技术之一。 　　一、材料与方法 　　1.材料与试剂 　　海洋分枝杆菌：中国兽医微生物菌种保藏管理中心。 　　NaOH溶液（4%，此为体积/质量分数，以下同）;灭菌生理盐水（0.9%）;蛋白酶K（20 mg/mL）;SDS（10?）;醋酸钠（3 mol/L，pH5.2）;TE 缓冲液（pH 8.0）。 　　2.仪器与设备 　　罗氏480荧光PCR检测仪 瑞士Roche公司;Centrifuge 5417R高速台式冷冻离心机（0～20 000 r/min） 德国Eppendorf公司;普通台式离心机 美国Thermo Biofuge PrimoR 公司;LA2-5AX生物安全柜 新加坡ESCO公司。 　　3. 方法 　　（1） 引物和探针的设计与合成 　　用DNAStar软件比对GenBank公布的海洋分枝杆菌DNA序列中比较保守的区域，设计引物和探针。引物和探针序列见表1。检测引物和探针由宝生物工程（大连）有限公司合成。 　　表1 荧光定量PCR检测引物和探针 　　Table1 Quantitative PCR primers and probes 　　引物和探针序列 扩增片段大小/bp 　　上游引物P1：5’-GGTCGACACATAGGTGAGGTCT-3’ 103 　　下游引物P2：5’ -CGCTGATCCGGCCAC-3’ 　　探针：5’-FAM-CCGAAGCGGCGCTGGACGAG-TAMRA-3’ 　　（2） 标准阳性质粒的制备 　　样品提取采用商品化DNA提取试剂盒进行样品提取。以提取的阳性样品DNA为模板进行PCR扩增，扩增后PCR产物进行琼脂糖凝胶回收，连接至Promega pGEM-T easy 载体，并转化到JM l09感受态细胞，筛选挑取阳性克隆，进行PCR鉴定。用质粒提取试剂盒提取质粒，测序后，使用紫外分光光度计测定阳性标准质粒的浓度，计算其拷贝数后-20 ℃保存备用，即得到阳性标准品。拷贝数根据下式计算。 　　拷贝数/（copies/μL）= c/m×6.02×1023 　　式中：c为阳性标准质粒的浓度/（g/μL）;m为分子质量/（g/mol）;6.02×1023为1mol拷贝数/（copies/mol）。 　　（3） 配制反应体系 　　将总样品反应组分涡旋，充分混匀，向每个荧光PCR管中各分装反应液15 μL，转移至样本处理区。检验过程中分别设置阳性、阴性对照及空白对照。以含有扩增片段的质粒为阳性对照，以灭菌双蒸水为阴性对照。荧光PCR检测循环程序为：37 ℃，3 min;93 ℃，1 min;93 ℃，5 s; 60 ℃，40 s; 40 个循环。 　　（4） 反应体系优化 　　反应体系为25 μL，以退火温度56、57、58、59、60、61 ℃进行荧光定量PCR试验，优化退火温度。以Mg2+浓度3、3.5、4、4.5、5、5.5、6 mmol/L优化Mg2+浓度。引物和探针浓度分别以0.5、1、1.5、2、2.5 μL优化，采用矩阵法得到最佳的工作浓度。最佳反应条件是94 ℃，1 min;95 ℃，5 s;60 ℃，30 s;40个循环。 　　二、结果与分析 　　1.标准曲线的绘制 　　将1×108 copies/μL的质粒梯度稀释到1×102 copies/μL，采用已优化条件，将稀释的标准品模板进行荧光定量PCR检测，得到扩增曲线。以质粒浓度的对数值为横坐标，Ct值为纵坐标，绘制标准曲线。得到标准曲线方程为y=-3.30x+38.9，相关系数为0.998 0。 　　注：从左至右依次为1×108、1×107、1×106 、1×105 、1×104 、1×103 、1×102 copies/μL浓度模板的扩增曲线。 　　图1 模板为系列拷贝数质粒的扩增曲线（动力学曲线） 　　Fig.1